一份自然科学基金问题.doc

一、 项目设计简介（三）项目设计（目标、内容）口服“复方黄金香提取液”对创伤性脑水肿的临床应用研究1. 研究背景：随着创伤病人增多，我国颅脑损伤发生率超过100/10万人口，接近西发达国家150200/10万人口的水平，其死亡、伤残率居高不下，总死亡率一直在30%50%，每年耗费超过100亿人民币。其中继发性创伤性脑水肿（traumatic brain edema，TBE）是导致脑外伤病人伤残和死亡的主要原因之一。TBE发病机制很复杂，其临床表现主要是脑水肿后产生颅高压症状，发生脑疝，严重者死亡。传统以甘露醇脱水利尿为主的综合治疗效果目前仍然欠佳，且甘露醇的副作用大，并发症多。 为此，目前国内外中西医领域都针对TBE开展了积极的研究，已从过去的形态学深入到了分子生物学领域。其中水通蛋白4（aquaporin 4，AQP 4）是近年来研究的热点。有研究发现AQP 4在TBE发生中起重要作用，其表达受多种因素影响。1993年以来，我们对创伤性脑水肿进行了系统的临床观察研究。结合中医辨证论治和现代中西医药的研究，从古今中药方剂（血腑逐瘀汤、桃红四物汤、复元活血汤、补阳还五汤等）中筛选出有效药物，予以重新立法组方取名为“祛瘀通腑汤”。改传统的单纯用甘露醇等脱水利尿为祛瘀通腑（泄泻、通便）、大小便均通畅的新疗法。由于该中药汤剂药效浓度低、杂质多而不纯、煎制麻烦等弊端，故近年我们将“祛瘀通腑汤”改制成提取液口服，其主要药物为黄芪、金银花、麝香、三七、红花、大黄等。并重新命名为“复方黄金香提取液”治疗了大量创伤性脑水肿颅高压病人，获得了良好疗效，先后发表数篇论文于国外医学神经病学神经外科学分册, 2000、中华中西医杂志,2003、湖南医科大学学报,2000、中南药学2010等杂志。2. 研究目标：本研究拟通过观察病人症状、体征、影像学变化及该中药对脑脊液、血AQP4表达的影响及上游信号通路（PKC、CaMK、NF-B）的调控及时间/疗效的关系，从而证实口服“复方黄金香提取液”治疗TBE的疗效，以便进一步研发推广。3. 研究内容：1) 完善创伤性脑水肿患者病情评估体系，包括病人症状、体征、昏迷评分(GCS)、；颅内压(intracranial pressure，ICP)、脑灌注压(cerebral perfusion pressure，CPP)、CT/MR，AQP4、炎症因子、凝血酶（thrombin，TM）、内皮素（Endothelin，ET）的表达水平测定；2) 通过中药“指文图谱”选用该方剂的地道中药，采用复合酶法新工艺制备口服“复方黄金香提取液”；3) 评估口服 “复方黄金香提取液”后病人症状、体征、GCS、ICP、CPP、CT/MR，AQP4、炎症因子、TM、ET的表达水平情况；4) 检测PKC、CaMK、NF-B上游信号通路相关分子的表达（相关试剂盒）；5) 用RT-PCR、Western blot、免疫组化方法检测口服“复方黄金香提取液”对TBE病人AQP4表达的影响。二、项目先进性、可行性（一）项目的先进性（500-2000字）目前，治疗TBE的主要原则是改善灌注、氧供、降低脑组织代谢水平，减少离子梯度和张力梯度的变化。尽管各种治疗手段对TBE有一定疗效，但效果仍不满意，其残废率、死亡率仍高达30%50%。原因很多，其中较为公认的原因：（1）未能有效改善脑缺血缺氧、微循环障碍及由此导致的一系列病理生理改变；（2）未能有效控制神经细胞和微血管内皮细胞钙超载及氧自由基等神经递质的作用；（3）由于耐药和药物的个体差异，迄今未找到治疗TBE的特效方法和药物。近年来我们在原祛瘀通腑汤的基础上，采用改良后的中药方剂(复方黄金香提取液)干预大鼠TBE后能明显减轻脑水肿，其AQP4的表达水平显著下调，其效果明显优于“祛瘀通腑汤”， 与目前国际上对AQP4在TBE发生机制中重要作用的最新认识相符。其次，临床观察中发现TBE突出的表现为缺血缺氧（低氧）及炎症反应。这类病人表现出的缺血缺氧（低氧）及炎症反应，与中医辨证的血瘀气滞、气血两虚、痰湿扰心等理论相似。总结我们过去的治疗经验发现，原“祛瘀通腑汤”中没有补气化痰类药，故我们加用补益气血、引血归经、清热、利湿、化痰类药组成“复方黄金香”方剂，采用复合酶法制成“复方黄金香提取液”治疗，以达到既要祛瘀通腑又要益气解瘀、利湿化痰，如此双管齐下的方法治疗TBE。还可以充分利用提取药物的有效成份（去除了杂质）进行治疗，更有利于病人的康复。该项目经数十年治疗TBE的实践，具有很强的实用价值。首次提出“益气化痰、祛瘀通腑”法治疗TBE的新立论，不囿于传统的脱水、利尿和单纯的祛（化）瘀通腑疗法。筛选有效中药方剂，创新组成新的方剂 “复方黄金香提取液”，配方严谨合理有效。复合酶法提取复方中药（去除杂质，保留有效成份）未见报道（制备过程见图1）。首次研究“复方黄金香提取液”对TBE AQP4表达的影响及上游信号通路（PKC、CaMK、NF-B）的调控及时间/疗效的关系。（二）项目的可行性（500-2000字）1科室优势本单位研究脑水肿、颅高压30余年，经验丰富，技术力量雄厚，设备先进、齐备。目前已成为湖南省规模最大、急诊就诊人数最多，具有先进急救服务理念与现代化设施，集内、外、妇、儿、眼、耳鼻喉、口腔、神经内外科各种危急重症、创伤、中毒病人救治为一体，24小时应诊的大型综合性急救医学科。年接诊急诊病人10万余人次，急诊留观病人4万多人次，抢救各类危重病人7000余人次，同时为国家新药临床试验基地。近3年发表学术论文共40余篇，其中SCI论文2篇，CSCD论文20篇，承担省部级获课题9个，总经费47万元。主编著作3 部。先后有多人作为访问学者前往德国、瑞典、美国、日本等国学习。2医院优势中南大学湘雅二医院是一所卫生部直管、国内学科最齐全、湖南省规模最大、技术力量最雄厚的大型三级甲等医院之一。医院作为湖南省内综合技术实力及师资科研力量最强医疗机构之一，现有在岗正式职工3171人，其中高级专业技术人员598人；占地面积220余亩（其中医疗用地140亩），医疗建筑面积22.26万平方米，编制床位3500张；设有26个教研室、40个临床科室、8个医技科室、72个病区以及7 个研究所、23个研究室（中心）；固定资产总价值15亿余元，其中仪器设备总价值近7亿元，拥有PETCT、23EX高能直线加速器、国际最先进的数字减影心血管造影仪（DSA）、核磁共振仪等千万元以上设备7台（件）。3临床工作基础申请者于1993年以来，开展了“祛瘀通腑汤”治疗TBE的临床实验研究，积累了丰富的经验。已熟练掌握建立TBE模型（TBI模型改良），已发表数篇相关论文。复合酶法提取天然植物药技术成熟，已产业化，复合酶法提取复方中药方剂已获成功（制备过程见图1）。 预实验证实“复方黄金香提取液”（祛瘀通腑汤改良）治疗TBE已获显效，能显著下调AQP4的表达中南药学，2009（结果见图2-A、B、C、D，图3）。TBE组 Sham组 图2-B TBE 24小时组 200 坏死神经元，神经元周围的组织间隙水肿、坏死明显呈筛网状改变。图2-A 假手术（对照组） 200 正常神经元, 空泡变性的神经元。祛瘀通腑汤组 图2-D复方黄金香提取液24小时组 200与祛瘀通腑汤组相比，复方黄金香提取液组更能显著改善脑水肿。复方黄金香提取液组 图2-C 祛瘀通腑汤24小时组 200 发生水肿的神经元, 神经元周围的组织间隙水肿，但程度较创伤组24小时组明显好转。图2. “复方黄金香提取液”（祛瘀通腑汤改良）治疗TBE大鼠病理组织检查图3. 24小时后Western blot检测复方黄金香提取液对TBE大鼠AQP4蛋白表达影响 *与Sham组相比，TBE组AQP4的蛋白表达显著上调（P0.05）；与TBE组相比，祛瘀通腑汤AQP4的蛋白表达下调（P0.05）；与祛瘀通腑汤组相比，复方黄金香提取液组显著下调AQP4的蛋白表达（P0.01）附病人CT图片图3 “黄金香复方剂”与甘露醇治疗TBE患者的CT照片对比： A2 甘露醇与黄金香复方剂联合治疗后2周后右额叶血肿吸收、水肿明显减轻额叶血肿、水肿A1甘露醇治疗前右额叶血肿、水肿例1：罗，（女，46岁） 住院号 786978 颅脑外伤右额叶脑挫伤、血肿（两周后CT复查A2）例2：贺（男，38岁）住院号789053 颅脑外伤右额叶底脑挫伤、血肿（两周后CT复查B2） B2 甘露醇治疗后2周后右额叶底血肿未吸收，仍水肿B1 甘露醇治疗前右额叶血肿、水肿 结果：以上CT片对比表明，“黄金香复方剂”与甘露醇治疗TBE患者，其血肿、水肿等病变吸收，前者明显快于后者（A 好于B ）。（三）项目现有工作基础及建设意义（1000-2000字）1工作基础本项目负责人系中华医学会急诊医学分会创伤专业委员会会员、中华医学会湖南分会神经外科学会和急诊医学会委员、湖南省中西医结合急诊医学分会副主任委员及中西医结合学会理事等职。长期从事急诊、脑外伤、脑水肿颅高压中西医结合临床和基础研究，创伤性脑水肿中医药治疗研究更是申请者的特色之处。先后多次承担省部级攻关课题，其中包括教育部国家重点实验室开放课题资助、主持国家973计划（校际合作 子课题）(2007CB516809, 2007CB914203，2007-2009)：人脑低级别胶质瘤与其周围脑组织蛋白质组学差异蛋白表达；第一负责人。运用蛋白质组技术探讨HIF-1在脑损伤中的作用机制（2009106，2009-2011）；教育部湖南师范大学国家重点实验室开放课题1万（标本、开会等）其余费全由对方付，第一负责人。祛瘀通腑汤治疗创伤性脑水肿颅高压的临床与实验研究湖南省卫生厅课题（98211）、复方黄金香提取液对TBE大鼠AQP4表达的影像湖南省卫生厅课题（2006042）。1998年主持进行祛瘀通腑汤治疗创伤性脑水肿颅高压的临床与实验研究课题，并成功建立了大鼠创伤性脑水肿模型。2001年主持进行祛瘀通腑汤对脑损伤后脑组织MDA和SOD变化的影响动物实验研究，初步揭示祛瘀通腑汤对创伤性脑水肿具有较强清除氧自由基、改善脑微循环等的作用。2007年领导项目组在“祛瘀通腑汤”基础上改良，增加能补益气血、清热、利湿化痰等作用的药物。采用复合酶法提取新工艺制成“复方黄金香提取液”，开展了TBE大鼠的预实验，结果证明能显著下调AQP4的表达，并能明显减轻脑水肿。近3年共计学术论文 13 篇，其中SCI收录论 3篇。项目组成员承担并参与多项研究课题，包括国家自然基金、卫生部科学研究基金、教育部重点实验室、湖南省教委、湖南省卫生厅等科研课题，“颅内压与脑水肿的系列研究”，1998年获湖南省医药卫生科学技术进步奖。项目负责人及课题组成员已建立TBE模型（改良），长期开展脑外伤、脑水肿、颅高压的研究，对“祛瘀通腑汤”治疗TBE研究积累了丰富的经验。已掌握了复合酶法提取“复方黄金香方剂”的新工艺制备技术2007年已开展“复方黄金香提取液”治疗TBE大鼠的预实验。本项目组在中医药防治TBE的基础研究领域已经取得一些重要的研究成果，在治疗TBE中药研究方面，对复方黄金香提取液的药理作用机制进行了研究，其论文复方黄金香对TBE大鼠AQP4表达的影响发表在中南药学，2009，7（3），165-167。这些研究成果为本项目研究奠定了重要的理论基础，提供了坚实的试验技术保障，同时培养了一批理论扎实、技术熟练的研究人员。本教研室具有完善的试验设施，申请者目前每年招收博士研究生人员数名。这些为本项目的顺利实施奠定了坚实的基础。2工作条件本单位拥有遗传学国家重点实验室，医学中心实验室，动物场等实验研究条件。本单位设备先进、齐备，可满足本项目原位杂交、电镜、MRI、Western blot 、RT-PCR/免疫组化等的检测。本课题由教授、讲师（主治医生）、博士、硕士等组成，成员梯队结构合理（神外、神内、急诊医学、化学、分子生物学等），专业知识水平高，素质好，身体好，有时间保障。本研究室具有数据库软件包，用于大型数据保存、调用、分析等。本单位每年都承担国家、省部级等多项重点研究课题、信誉高。有能力、有条件，能如期保质保量完成本项目研究。本研究室为国家临床药物试验机构，已建立完善药物临床试验管理体系及规范化流程。 3建设意义通过项目建设研究将从分子水平探讨本方立法“益气化痰、祛瘀通腑” 的科学依据，阐明该提取液下调AQP4表达的调控机理，为今后研发“复方黄金香提取液”提供试验依据。从而为TBE的治疗提供一种更好的方药，进一步促进中西医结合防治TBE的研究进步和发展。因此，本项目的完成将可能产生重大的社会效益和经济效益。（四）社会效益（社会需求量及其依据、对提高医疗质量，扩大医疗服务范围，解决群众看病就医有何积极意义）项目建设以中医理论为指导，中西医结合为中心，围绕创伤性脑水肿的发病机理，制定凸显中医特色优势、理发方药相一致、体现中医学术思想及现代中医新技术的规范化中医临床诊疗方案，形成能够充分发挥中医综合调节和辩证论治的优势，包括中医药治疗方法在内的综合治疗方案或疾病预防方案，并按照临床流行病学的研究方法，结合中医的临床特点进行疗效评价，建立证据确凿、可供推广的有效治疗方案。带动急救医学学科建设、医教研工作、中医药临床科研攻关、人才培养各项工作，为规范医疗行为，提高医疗质量及临床疗效具有重要意义，并能取得良好的社会效益。中药方剂“复方黄金香提取液”对TBE的治疗疗效显著，降低TBE病人的伤残、死亡率，促进康复，减少经济损失和社会负担。三、项目规划围绕项目目标、内容，安排项目进度（限定在3年内）（500-2000字）2012年1月2012年12月：完善创伤性脑水肿患者病情评估体系，包括病人症状、体征、GCS、ICP、CPP、CT/MR，AQP4、炎症因子、TM、ET的表达水平测定；通过中药“指文图谱”选用该方剂的地道中药，采用复合酶法新工艺制备口服“复方黄金香提取液”。2013年1月2013年12月：依据纳入标准选取TBE患者100例，随机分为“甘露醇”治疗组及“复方黄金香提取液”治疗组。评估口服 “复方黄金香提取液”后病人症状、体征、GCS、ICP、CPP、CT/MR，AQP4、炎症因子、TM、ET的表达水平情况；检测PKC、CaMK、NF-B上游信号通路相关分子的表达（相关试剂盒）。2014年1月2014年12月：用RT-PCR、Western blot、免疫组化方法检测口服“复方黄金香提取液”对TBE病人AQP4表达的影响；总结分析实验结果、项目审核、论文上报。四、项目实施需解决的关键问题（一）项目实施需解决的技术研发问题（应当围绕解决疾病诊疗问题）（500-2000字）1.“复方黄金香方剂”的复合酶法新工艺制备技术；2. 脑水肿MRI波谱分析技术；3.脑水肿相关蛋白分子的表达测定；4. 脑水肿相关蛋白分子的表达测定。（二）项目实施需解决的人才培养问题（500-2000字）全面提升科室中医师素质和学历，医护人员数量、年龄结构、学历结构、职称结构合理。每年吸收 1-2 名优秀博士毕业生，5 年内医师博士比例达到 80%。提升学术地位（省市、国家级学术团体任职和国家级期刊任职）。在完善亚专科建设同时，对每一专科人员进行合理的配置，保持一定的梯度。有计划将年轻专业人员送到国内级国外培训。不断提高医师医疗技术水平，确保医疗质量和医疗安全，组建一支医疗技术全面、具备可持续发展能力的急诊医学诊疗技术队伍，为人民群众提供优质医疗服务。（三）项目实施需解决的关键设备问题（设备购置计划）1.颅内压监护仪；2.指纹图谱仪；3.MRI波谱分析仪。（四）项目实施需解决的其他问题无五、项目经费总预算项目经费总预算金额： 200 万元 其中：申请拨款金额： 100 万元 单位配套金额： 100 万元 其他经费金额： 0 万元（一）项目支出详细预算：支出科目金额（万元）计算根据及理由设备费100购买仪器40购买仪器（单位配套）实验材料费28中药/生物提取/各种试剂/动物等（单位配套）2动物饲养/观察等（单位配套）科研协作费20与公司和机构合作（单位配套）组织实施费3研究生劳务费（单位配套）2试验场地的管理（单位配套）其他费用3项目成员出国交流（单位配套）2境外专家来院交流合作（单位配套）合计200-注：金额以人民币计； 如申请“实验材料费”、“科研协作费”，请附预算细目。（二）仪器设备费详表No品名参考型号生产厂/国别数量单价(万元)金额(万元)备注1多参数颅内压监护仪MPM-1Integra LifeSciences corporation/英国1303018.5万元2中药指纹图谱仪GoodLook-1000型全自动薄层成像系统(中药指纹图谱分析)上海科哲生化科技有限公司/中国112123核磁共振波谱分析软件FT-NMR日本电子株式会社/日本1585835万元合计(数量、总金额)：（金额以人民币计，需要进口设备的可在备注栏注明美元金额）六、申请项目装备主要仪器的必要性及预期效益（1000-2000字）随着科技的发展，人们越来越认识到中药的药效不是来自单一的活性化学成分，而是来自多种活