HPLC实验讲义.doc

实验一 反相化学键合高效液相色谱法分析芳香族化合物目的要求 1、了解高效液相色谱仪各部分的构造及功能。2、掌握反相化学键合相色谱的基本原理。3、学会简单样品的分析操作过程。基本原理高效液相色谱法以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。液相色谱根据固定相的性质可分为吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱、离子色谱、离子对色谱及空间排阻色谱等。其中反相化学键合相色谱应用最广，化学键合相色谱法是将有机分子通过化学反应键合到担体（多为硅胶）表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。不同组分的分离基于它们在两相中的分配系数不同。反相键合相色谱一般采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用较广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的ODS（Octadecylsilyl）柱。仪器试剂Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪（带紫外检测器）苯标准溶液：10%苯的甲醇溶液；甲苯标准溶液：10%甲苯的甲醇溶液；苯、甲苯混合溶液；甲醇（色谱纯）。实验步骤一、测定前的准备工作1.样品与流动相的处理流动相一般应使用色谱纯，分析纯试剂需经过溶剂过滤器过滤（0.45 m 的一次性过滤膜），纯有机相或含一定比例有机相的要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。2.更换泵头里清洗瓶中的清洗液流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用85%的甲醇水溶液；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。3.排除泵内气泡开关排气阀时泵一定要关掉。具体操作如下：（1）在泵关闭的情况下，打开排气阀。（2）选择要排气泡的通道，打开泵。（3）按下泵前面板右下方的“Purge”键，仪器将以6.0 mL/min 的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5 分钟将自动停止。若想想手动停止，则再按再按“Purge”键，将停止清洗。注意：使用快速清洗阀时，只能一个一个通道的排气泡，不得将几个通道同时按比例排气泡，比例阀的快速切换易导致损坏。流路中没有气泡后，将泵关掉，再关排气阀；排气阀不能拧的过紧，也不能拧的过松，拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警。4.设置柱温箱的温度按住柱温箱上的“+”或“-”键，直到数字开始闪烁时设定温度。5.系统的准备（1）分析样品前先用甲醇，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。（2）第1 步完成后，更换分析样品所需流动相冲洗流路约20 分钟，待基线走平后即可进样。二、样品的HPLC分析1.选择色谱条件：色谱柱：VP-ODS（150mm4.6mm）流动相:甲醇流量： 0.8mL/min；检测器：紫外光度检测器，254nm； 2.苯和甲苯的定性分析用微量注射器分别注入苯标准溶液、甲苯标准溶液及苯和甲苯的混合溶液各10L，在线观