人脐带血间充质干细胞技术研究进展2.doc

人脐带血间充质干细胞技术研究进展胡晓玉(盐城师范学院生命科学与技术学院095班 学号：09243402 邮编;224000)摘要：人脐带中富含间充质干细胞（MSCs）。这些细胞能表达多种间充质干细胞标志物及多种干细胞相关基因，能分化为3个胚层衍生的多种成熟细胞、合成多种营养因子和细胞因子、支持造血干细胞等细胞的增殖和功能，并具有低免疫原性。本文主要对脐带血间充质干细胞的分离培养，生物学特性,分化能力以及应用方向作简要综述。关键词：脐带；间充质干细胞；分化中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：ISSN1006-2947(2011)02-0001-06Research progress of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood technologyHU Xiao-YuYancheng teachers college of college of life sciences and technology class 095 Student number：09243402 Zip code:224000Abstract: Rich in human umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs). These cells Express multiple markers in mesenchymal stem cells and multiple genes related to stem cells, can be differentiated into 3 mesoderm-derived variety of mature cells of, synthesis and a variety of nutritional factors such as cytokines, hematopoietic stem cell proliferation and function of cells, and have low immunogenicity.This article on umbilical cord blood mesenchymal stem cell isolation and culture of, biological characteristics, differentiation and applications provide a brief summary.Keywords: umbilical cord;mesenchymal stem cells;differentiation(引言)间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）应具有如下基本特征：贴壁生长；具有特定的表面标志，如不表达CD14、CD34、CD45、HLA-，但表达CD29、CD73和CD105；能进行自我更新，也能在体外分化为骨、软骨和脂肪等多种细胞系。虽然不同研究组对人脐带中分离出的细胞给出基质细胞、基质干细胞和MSCs等多种命名，但通常均具有上述基本特征。人脐带来源的MSCs具有如下优点：获取过程无伦理和道德等约束。含量高、增殖能力强。获取成功率高。其获取过程为非侵袭性操作。细菌和病毒感染风险低。具有多分化潜能而无形成畸胎瘤的风险。低免疫原性。因此，有理由相信人脐带MSCs将在细胞治疗和组织工程等方面具有广泛的应用前景。1 MSCs 的分离分离方法1）密度梯度离心法：此方法最常用，先是用淋巴细胞分离液从脐血中分离出单个核细胞，再依据MSCs 在体外培养中贴壁生长的特性，用贴壁筛选法，将其从造血系统细胞中分离出来。2）流式细胞仪分离法：根据间充质干细胞大小不同或细胞表面的一些特殊标记CD44、CD29和CD105等，采用流式细胞仪对其进行分选；3)免疫磁珠分离法：原理是使用表面覆有特异性抗体的磁珠与间充质干细胞结合，再用永久磁铁吸引出间充质干细胞；4)羟乙基淀粉沉淀法：此方法是将医用HES 与脐带血按一定比例混合，静止沉淀一定时间，取上清液离心后再根据其贴壁选择性，分离出MSCs；5)沉淀法与离心法结合：是将脐带血用HES 沉淀后，再重复密度梯度离心法的操作来获取MSCs。除上述方法外，也有学者利用单细胞克隆的方法获得纯MSCs 的细胞株，但该方法不便于大量获得MSCs。2 MSCs 的培养对于MSCs 的培养，目前还没有统一的方案。所采用的培养基大致有以下几种：IMDM 培养基，LG-DMEM 培养基，DMEM+F12 培养基以及MesencultTM 培养基；所应用的血清浓度也有不同的报道：Lee OK所用浓度为20%；程范军等则将2%与10%血清浓度做对比得出的结论是，采用低浓度血清培养体系，更有利于MSCs 的倍增和增值维持；而对于MSCs 种植密度的选择也没有统一的认识。但多数实验研究认为，原代培养的脐带血MSCs 多在培养2448h 后出现贴壁，1周左右呈梭形，并成克隆性生长，45 周可达80%以上的融合。起初培养的干细胞中可见多核，形态扁平的破骨样细胞混杂，一般传代至第3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形的间充质干细胞。3 MSCs的生物学特性3.1 基因分析 对人脐带MSCs进行基因分析表明，该细胞与造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）和胚胎干细胞（embroynic stem cells, ESCs）类似，其高表达的常见基因包括未分化的ESCs表达的基因、形态发生相关蛋白、细胞外黏附分子、神经营养因子以及3个胚层衍生的子代细胞标志物。此外，RT-PCR分析显示人脐带基质干细胞还表达多种未分化细胞标志、3个胚层和滋养外胚层相关的基因和一系列多能干细胞标志，如Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81。3.2 细胞标志物的表达 以流式细胞学技术、PCR技术、微点阵方法和免疫组织化学方法对脐带基质细胞的表面标志表达情况进行分析的诸多研究表明，这些细胞与其他来源的MSCs类似，表达CD10、CD13、CD29、CD44、CD49 b、CD49 c、CD49 d、CD49e、CD51等；但不表达CD14、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD56、CD123、CD133、CD235a、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR和Strol-1。3.3 端粒酶活性 端粒酶活性在干细胞的增殖能力方面发挥重要作用。有人发现脐带基质细胞的端粒酶活性为肿瘤细胞系的10% ，端粒酶的反转录酶基因呈高水平表达，也有人以-半乳糖苷酶染色进一步证实了端粒酶的持续表达。然而，还有人认为，在培养初期端粒酶活性较为稳定且高于正常水平，此后逐渐下降至HeLa细胞系水平以下。3.4 体外分化潜能3.4.1 向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的分化 向中胚层衍生的各种成熟细胞的分化能力是MSCs的基本特征之一。研究表明，人脐带MSCs能分化为具有成熟脂肪细胞结构和功能的细胞，也能分化为骨细胞并表达骨桥蛋白、涎蛋白、骨连接素和骨钙素等标志物，还可在黏多糖的基质上形成类似于关节软骨的、直径12mm的球状骨针。3.4.2 向心肌和骨骼肌细胞分化 胞嘧啶核苷的类似物5-氮杂胞苷是诱导干细胞向心肌细胞分化的关键物质。研究表明，以5-氮杂胞苷或心肌细胞共培养体系均可将脐带MSCs诱导为表达钙黏蛋白和心肌肌钙蛋白的心肌样细胞，还可形成心肌细胞特有的肌管结构，并有自发跳动。此外，通过免疫分选获得的CD105+脐带MSCs还能被诱导为表达Myf5和MyoD的骨骼肌细胞。3.4.3 向神经细胞分化 向神经细胞的分化潜能是MSCs研究的热点之一。先以碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预处理过夜，再以多种化学试剂进行诱导可将脐带MSCs转化为表达-III型微管蛋白和神经纤维蛋白M神经元样细胞；如以神经元条件培养基进行诱导可得到表达谷氨酸诱发内向电流的成熟神经元；如再加入sonic hedgehog和bFGF则可得到表达酪氨酸羟化酶的多巴胺能神经元。3.4.4 向肝细胞样细胞和胰岛细胞样细胞分化 体外扩增的脐带MSCs能表达多种肝细胞标志物，如白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白1连接蛋白-32和二肽基肽酶等。诱导后的细胞不仅上调这些标志物的表达水平，还贮存糖原并产生尿素。此外，人脐带MSCs也能被诱导分化为胰岛细胞样细胞团，并根据培养液中的葡萄糖浓度调整胰岛素的释放量，还能合成和分泌C肽。这提示该细胞群有望成为肝细胞和胰岛细胞的备选来源。3.5 支持功能3.5.1 支持HSCs的扩增 支持造血是MSCs的特征之一。脐带MSCs能够长期、有效地支持CD34+脐带血HSCs，其扩增HSCs的能力与骨髓MSCs相似，有望替代骨髓MSCs成为新的细胞来源。3.5.2 维持胰岛样细胞团存活和功能 人脐带MSCs能分泌多种细胞因子，如白介素-6、金属蛋白酶-1/2组织抑制因子、单核细胞趋化蛋白-1、生长相关癌基因、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白4和白介素-8等，从而维持胰岛样细胞团的存活，并提高其胰岛素表达水平。3.5.3 扩增脐带血来源的自然杀伤细胞 自然杀伤（NK）细胞对于过继免疫治疗具有重要意义。人脐带MSCs与细胞因子（IL-2、IL-5、IL-3和FTL-3L）联合应用可显著扩增脐带血CD56(+)/CD3(-)NK细胞，为获得足量NK细胞以满足临床需求奠定了基础。3.5.4 支持ESCs 新近有研究者发现，以人脐带MSCs作滋养层的ESCs能在体内分化为内、中、外3个胚层的细胞，还能在体外分化为造血细胞。这表明人脐带MSCs可作为ESCs的滋养层细胞。3.6 免疫原性免疫抑制和免疫豁免是MSCs的特征之一。人脐带基质细胞的免疫抑制作用具有一定的特异性，这可能与免疫调节分子（血管内皮生长因子和白介素-6）、协同刺激表面抗原（CD40、CD80和CD86）和HLA-G6的表达有关。然而，人脐带MSCs可被干扰素-激活而提高MHC类分子的表达水平并表达MHC类分子，如将其多次注射于炎症区域或注射前应用干扰素-则能诱发免疫反应。因此，用于临床的细胞治疗前尚需充分评估其免疫原性。4 HUCB-MSCs 的应用研究 脐带血间充质干细胞的可获得性、可扩增性及可多向分化性为我们展示了良好的研究和应用前景，故可作为一种新的细胞来源用于细胞替代治疗、基因治疗以及组织工程等应用研究。4.1 MSCs 移植的研究4.1.1 治疗血液性疾病 许多研究发现MSCs 通过细胞间接触、分泌各种造血因子及生成骨髓基质而有利于造血干细胞的体外扩增、造血干细胞移植后的归巢及植入、可缩短移植后骨髓造血功能恢复的时间，并在许多动物实验和临床治疗中得到证实；另外，间充质干细胞还可通过直接的细胞接触、分泌细胞因子、诱导嵌合体形成、诱导免疫耐受、对机体免疫具有负调控作用，从而为临床治疗异基因造血干细胞后GVHD 的发生开辟了一条新途径。4.1.2 修复损伤神经 目前许多学者正尝试将MSCs 作为种子细胞用于神经退行性疾病，神经免疫性疾病，神经损伤性疾病以及脑血管疾病的治疗。廖文斌等通过建立大鼠脑出血和脑缺血模型，将MSCs 注射到局部后，与对照组对比发现，MSCs 可以有效促进脑缺血和脑出血大鼠的神经功能恢复，并有免疫抑制和抗炎作用。4.1.3 修复损伤或衰老的组织器官 近几年，干细胞移植治疗中晚期肝病成了一个热点话题。目前对MSCs 向肝细胞的诱导分化多数还是采用诱导因子进行体外诱导。业已证明利用FGF4 和HGF 可将UCBMSCs诱导为具有肝细胞形态和表型的细胞，并有可能通过将来的进一步研究，使其为肝细胞工程、生物人工肝提供种子细胞，以期用来治疗各种急、慢性肝功能衰竭和肝脏代谢性疾病。此外，柯红燕等将MSCs 移植到心肌梗塞模型的大鼠心肌内，发现MSCs 在大鼠体内能够存活并能分化为心肌样细胞，但MSCs 分化为心肌细胞的机制以及能否在体内转化为有功能的心肌细胞还有待于进一步的研究。另外，MSCs将来亦可有望用于治疗糖尿病，骨及软骨组织病等组织器官的修复和再生。4.2 组织工程或基因治疗中应用 组织工程或基因治疗是近年来医学领域乃至生命科学领域研究的热点和前沿，为人类征服许多疾病提供了新的途径和希望，而这其中一个关键问题就是种子细胞或转基因载体细胞的选择。所以UCB-MSCs 因其高度的自我更新和多向分化潜能在这些领域展现了广阔的应用前景。Turgeman G 等取骨质疏松患者的骨髓MSC 行体外培养扩增并转BMP22，将转染后MSCs细胞移植入体内，发现可以异位生成骨和软骨，并能修复鼠桡骨骨损伤。陈晓梨等将逆转录病毒（pLEGFP2N1）转染的人凝血因子（hF）基因转入MSCs 中，与对照组对比发现，转染hF后的MSCs 可检测到有凝血活性的hF，这为MSCs 作为生产F的理想靶细胞提供了理论基础，又由于MSCs 的低免疫原性，使其在作为基因治疗的载体细胞治疗血友病B上展现了极大的优势。此外，MSCs 作为新型的基因治疗的靶细胞，在神经系统疾病和循环系统疾病等方面亦展现了可喜的应用前景。4.3 MSCs 免疫调节活性的应用MSCs 本身免疫原性低，表达中等水平的MHC-类分子，不表达MHC-类分子，可以通过分泌可溶性细胞因子诱导T 细胞活化受阻，改变T 细胞和DC 的表型，以及在体外可以明显抑制CD4、CD8T 细胞增殖，所以MSCs 以其上述特性，向我们展现了其在抑制异原性排斥反应和GVHD，延长移植物存活时间等方面的潜力和应用前景，并引许多研究者极大的兴趣。BALL 等最近报道14 位患儿行亲属不全相合的CD34细胞联合MSCs 移植，结果所有患儿都获得快速稳定的造血植入，并没有感染增加趋势，而历史对照中植入失败发生率为15%。Veronika 等在用MSCs 治疗糖尿病的研究时，将异基因骨髓和MSCs 联合输注到亚致死剂量照射的型糖尿病鼠模型内，血糖和胰岛素水平很快恢复正常，同时在老鼠体内没有发现供者来源的 细胞，作者分析可能是MSCs 的免疫负调节作用，抑制了 细胞特异性T 淋巴细胞活性而逆转了 细胞的功能。5 HUCB-MSCs 研究中存在的问题与展望 脐血源性MSCs 与骨髓源性MSCs 相比，具有获得方便，无创伤性，污染机率低，免疫源性更原始等特点。尽管近年来对脐带血MSCs 的研究取得了很大进展，但仍然存在许多问题尚待解决，还有待于进一步的研究和改善。5.1 分离、扩增和纯化问题 对于脐血中存在MSCs 已经毫无争议，越来越多的研究已经证实。但由于脐血中MSCs的数量少，生长周期相对缓慢，原代细胞培养时间较长，成为制约MSCs 应用的障碍，所以怎样从脐血分离出更多数量的MSCs，以及分离后以怎样的条件培养可以更好的扩增和纯化，以及怎样更好的保持MSCs 的可扩增性，有待于进一步的研究。5.2 MSCs 的鉴定问题 目前，对MSCs 鉴定的方法都是通过其在体外培养时发生的一系列形态学变化以及在培养过程中出现的分化表型，然后判断是否为MSCs。由于MSCs 的形态多样化，同时还伴有破骨样和树突状细胞的混杂，所以依据形态学鉴定存在一些弊端；同时由于MSCs缺少特异性的表面表记物，对其鉴定，也只是通过MSCs 表达CD29、CD44、CD90、CD95、SH2和SH3而不表达CD14、CD34、CD40、CD45和HLA-DR，由此逆推得知是否为MSCs；有实验研究利用基因表达系列分析技术，检测了由一个间充质干细胞形成克隆的整体基因表达情况，在分子水平揭示了MSCs 具有异质性和多样性；但同时MSCs 的这种特性，在其鉴定方面也增加了一定的难度。所以对于MSCs 的鉴定，目前还没有直接的方法，有待于进一步的研究探讨。5.3 MSCs 在细胞治疗、基因治疗和再生医学应用中存在的问题 MSCs 的自我复制和多向分化潜能，使其在未来的细胞治疗，基因治疗和再生医学中，具有很好的临床应用价值。目前在MSCs 应用中，很多问题还需要进一步研究、解决。如：是否可以应用多分脐带血的MSCs 进行移植，以解决MSCs 细胞数目有限的问题；采用怎样的方式将MSCs移植到受试者体内，才能有效提高MSCs 的利用率；由于不是所用注入的干细胞具有一致的归巢能力并都可以到达目的器官或组织，所以清楚细胞归巢机制，才可以提高MSCs归巢能力和利用率；如何保证植入体内的MSCs 定向分化为实体器官的特异细胞，减少其向其他非目的细胞的分化；如何保证干细胞分化而来的细胞具有目的细胞的特性和功能，如何与实体细胞融合，以及MSCs 定向分化为目的细胞的机制是什么；目的基因植入MSCs 后，如何保持其生存活性，以及基因治疗所面临的靶向性、转染效率、持续表达和可控性等普遍性问题。 以上各方面的问题，还有待于更深入的研究，但随着MSCs 在分离纯化技术、体外扩增、分化方向的调控等方面问题的解决，相信在不久的将来，MSCs 必定在细胞移植、组织工程、基因治疗等方面带给人类一份惊喜。参考文献:1. 范存刚, 周景儒, 张庆俊. 人脐带间充质干细胞的生物学性质研究进展. 基础医学与临床, 2010, 30(2), 215-218.2. 柯红燕，林晓波，应文娟，等. 人脐带间充质干细胞经体内定植并向心肌样细胞分化的研究J. 中国输血杂志，2009，22（3）:188-191.3. Zhau H