免疫酶组织化学技术.ppt

免疫酶组织化学技术 第一节基本原理 抗原 抗体 特异性 酶标记抗体 通过酶与底物作用生成有色反应物 定位组织或细胞内抗原的一门技术 免疫酶组化 免疫学 抗原抗体反应 酶细胞化学 底物显色反应 特异性敏感性定位性可视性 PAP法 免疫酶组织化学基本组成 抗原 抗体 放大系统 显色系统 ABC法 免疫酶特点 信号定位准确标本可长期保存阳性标记与病变关系方法简便 易推广 一 酶及其特点酶选择标准 该酶用细胞化学易于被检出 能被光镜或电镜观察 酶反应产物须稳定 不扩散 具有良好定位 第二节酶和底物 酶易于纯化 获得纯制品 酶与免疫球蛋白结合后 不丧失其活性 酶在PH中性液内较稳定 组织中不应存在与底物作用的内源性酶 符合上述条件 辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶 一 辣根过氧化物酶 HRP 分子量 40000 不会遮盖抗原的结合部位 稳定 易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳 生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物 产生不同颜色 HRP穿透力强 易进入细胞内 二 碱性磷酸酶 AKP 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用 三 葡萄糖氧化酶 GOD 底物为葡萄糖 终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大 穿透力较弱 二 底物及其特点酶 底物 酶 底物 酶 产物 显色 HRP的底物 HRP的底物为低浓度的H2O2 供氢体为胺类及酚类化合物 HRP显色反应 HRP H2O2HRP H2O 电子供体 氧化型 电子供体 电子供体被氧化后 迅速改变颜色 通过聚合等反应 生成不溶性有色颗粒 并就地原位沉淀 HRP常用的电子供体 3 3 二氨基联苯胺 DAB 棕色 氨乙基卡巴唑 AEC 红色 易溶于有机溶剂 易扩散 用水溶性封固剂 4 氯 1 茶酚 4CN 蓝色 易弥散 不能久保存 3 3 5 5 四甲基联苯胺 TMB 黄色 AKP底物 AKP常用的底物为 萘酚AS B1磷酸盐偶联试剂 固兰BB 蓝色固红TR 红色 第三节酶标记抗体法酶标记抗体法 EnzaymeLabelledantibody 是将酶通过共价键结合在抗体分子上 制备成酶标记抗体 通过抗体去寻找相应抗原 一 直接法原理 HRP标记在特异性抗体 第一抗体 上 抗原 抗体 HRP复合物 直接法 步骤 一步完成特点 方法简便 省时 专一性强 非特异染色轻 但敏感性差 一种标记抗体只能检测一种抗原 二 间接法原理 HRP标记在第二抗体上 抗原 特异性抗体 第二抗体 HRP复合物步骤 二步法 组织抗原 第一抗原 第二抗体 过氧化物酶 间接法 特点 敏感性较直接法高 一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体 检测多种抗原 但较直接法费时 非特异染色稍重 第四节酶抗酶法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物 酶桥法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体 抗酶抗体 HRP 一 PAP法原理 抗原 特异性抗体 第二抗体 桥抗体 PAP复合物步骤 三步法 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 PAP法 HRP 特点 敏感性较高 背景染色较轻但特异性抗体与PAP必须为同一种属动物 二 双PAP法 原理 在PAP的基础上再重复第二抗体和PAP复合物抗原 特异性抗体 第二抗体 桥抗体 PAP 第二抗体 PAP复合物 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 双PAP法 HRP 双PAP法 步骤 五步法特点 敏感性较高缺点 但步骤多 费时 非特异背景重 三 APAAP法原理 抗原 特异抗体 第二抗体 APAAP复合物步骤 三步法 APAAP法 特点 非特异背景较轻 不受内源性酶的干扰 但产物易溶于有机溶剂 第五节卵白素 生物素Avidin为一种硷性糖蛋白 由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力 一 ABC法AvidinBiotinComplex原理 酶标记Biotin形成酶素化Biotin 酶素化Biotin Avidin ABC复合物抗原 特异抗体 Biotin标记第二抗 Avidin Biotin HRP 组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素 ABC法 步骤 三步法特点 敏感性较高 特异性强 应用范围广 某些脏器存在内源性生物素干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂有非特异反应 SABC法StreptavidinbiotinPeroxidaseComplexSABC法已代替ABC法 二 LSAB法LabelledStreptavidinBiotinMethod原理 Biotin标记第二抗体 LSAB法 HRP标记Avidin抗原 特异性抗体 Biotin标记第二抗体 Avidin HRP复合物 步骤 三步法特点 敏感性高 特异性强 方法简便 第六节多聚合物酶法HRP 多聚合物 抗体一 Epos法Enhancedpolymerone stepstaining 多聚合物酶法 组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架 EPOS方法 原理 采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架 将特异性抗体和HRP 同时标记在多聚合物分子上 形成HRP 多聚合物 特异性抗体 步骤 一步法特点 快速 简便 特异性强 敏感性高但商品化种类不全 价格昂贵 二 EnVision法EnhancedLabelledPolymerSystem原理 HRP 多聚合物 第二抗体 组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架 第一步 第二步 EnVisionTM方法 特点 敏感性高 1mole复合物中含70moleHRP和10mole第二抗体 特异性强 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰 第七节基本操作步骤 1 抗原修复2 内源性过氧化物抑制3 正常血清封闭4 第一抗体 5 第二抗体6 酶标记体7 DAB H2O2显色 第八节抗原定位及非特异染色 组织细胞 固定问题 脱蜡不彻底 内源性过氧化物 内源性