抑制肿瘤实验方法.doc

抑制肿瘤作用检验方法1动物移植性肿瘤试验1.1原理使一批动物同时接种同样量的瘤细胞，并使其在体内生长，给予受试物一段时间后，观察瘤重或动物平均存活天数。1.2仪器和试剂洁净工作台，无菌解剖器械，生理盐水等。1.3实验方法1.3.1实验动物健康动物，雌雄均可，但同一批试验中受试物组与对照组性别必须相同，小鼠体重1822g，大鼠体重5070g，每组动物小鼠至少10只，大鼠至少8只，裸鼠可用510只。1.3.2肿瘤模型1.3.2.1小鼠肿瘤肉瘤180(S180)，肉瘤37(S37)，艾氏癌腹水型(EAC)，艾氏癌实体型(EC)，肝癌实体型(Heps)，HardingPassey黑色素瘤，未分化型胶质瘤G422等，可用昆明种小鼠。小鼠网织细胞白血病(L615)应用纯种615小鼠。小鼠淋巴细胞白血病L1210和P388应用纯种DBA/2或CDF小鼠或BDF小鼠。Lewis肺癌，黑色素瘤B16，小鼠乳腺癌(M5076)，应用C57BL/6纯种小鼠或BDF或CDF小鼠。1.3.2.2大鼠肿瘤瓦克癌肉瘤(W256)，软骨肉瘤，吉田肉瘤腹水型，用Wistar，SpragueDawley或Fisher大白鼠。1.3.2.3人肿瘤细胞株国际上常用的细胞株如人口腔癌细胞株KB细胞，宫颈癌细胞株HeLa细胞，卵巢癌细胞株A2780及国内建立的食管癌，肺癌及肝癌细胞株等皆可使用。以上肿瘤模型任造一种。1.3.3剂量分组受试物经口给予，连续30d，可在接种前开始给受试物，接种肿瘤后停用或继续给受试物，接种前给受试物天数由肿瘤接种成活率决定(观察是否比肿瘤模型对照组低)设肿瘤模型对照组及3个受试物组，受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量，小鼠扩大10倍作为其中一个剂量，大鼠扩大5倍作为其中一个剂量。应设已知受试物的抑制肿瘤阳性对照组。1.3.4实验步骤肿瘤的移植及结果观察1.3.4.1一般要求需在无菌条件下进行。可在接种罩、超净工作台或无菌室内操作。动物处死后，用新吉尔灭(11000)或碘酊、酒精消毒，对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的空针抽吸。瘤块污染常是接种失败的主要原因，应予注意在高温季节操作时，应注意降温，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块。常用腋下部位皮下作为实体瘤接种部位；肌肉接种则用大腿肌肉；腹水型接种于腹腔。1.3.4.2瘤块的制备接种用的瘤块应选择接种后710d、肿瘤生长旺盛且无溃破而动物健康较好的瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，用碘酊及酒精消毒操作部位皮肤(消毒面应尽可能大一些)。切开皮肤、选择生长良好无坏死或液化的瘤组织。在无菌平皿内，剪成23mm3的小块。平皿内放置少许消毒的生理盐水缓冲液或其它营养液，以保存瘤块。平皿应放置在冰块上。用无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块，接种于同种受体动物右前肢腋窝皮下(接种部位皮肤应先用碘酊、酒精消毒)。接种操作时间应尽可能的缩短，从一个瘤块所取的材料一般应在30min内接种完。1.3.4.3瘤细胞悬液的制备如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种。具体方法为，在无菌操作下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水适量稀释成1314的瘤细胞悬液。容器置冰块上，用空针抽吸，每次抽吸前应将细胞混匀。每个动物接种0.2mL。整个操作应在30min内完成。停止给予受试物之次日(或停止给予受试物后15d)处死动物，先称体重，后解剖皮下瘤块，称重。如对照组小白鼠肿瘤平均重量小于1g或20%鼠的瘤重小于400mg，大白鼠肿瘤平均重量小于2g，表示肿瘤生长不良。在试验期间给受试物组鼠死亡超过20%，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15%者，表示受试物的毒性反应。应当减少剂量重新试验。1.3.4.4腹水型肿瘤悬液的制备1.3.4.4.1抽取腹水选择接种后710d健康较好的动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤，用空针穿过腹部肌肉，抽吸腹水，放入无菌容器内，置冰块保存。若用几只动物供瘤时，应将腹水混合。另取小量腹水，置于加有肝素的干试管内，作为观察细胞形态及细胞计数用。将空针中剩余的腹水，滴一滴于载玻片上，推片，瑞氏染色，镜下进行细胞分类计数，其中瘤细胞数应95%。抽出之腹水应为乳白色之浓稠液体，若为黄色或有大量红细胞数应弃去。1.3.4.4.2细胞计数取置于肝素管内的细胞。用生理盐水稀释10倍及100倍；取稀释液0.9mL，加台盼蓝(0.2%台盼蓝生理盐水液)0.1mL，混匀。用白细胞计数法计瘤细胞总数。同时计算受感染的死细胞数。因瘤细胞死后，细胞膜的通透性改变，细胞可被台盼蓝染成蓝色。1.3.4.4.3接种腹水用无菌含葡萄糖的平衡盐水(如Hanks氏液、Gey氏液、洛氏液、Earle氏液等)稀释至适当的浓度，作腹腔注射，每鼠注入0.10.2mL。整个操作应在60min内完成。一般在试验结束后次日称体重，逐日记录。对照组动物通常在23周内全部死光，个别存活时间太长者需剔除，但各组亦应相应地剔除一只。如试验期间对照组动物于7d内死亡20%，表示试验失败。如对照组内20%动物存活4周以上，实验亦应作废，受试物组观察时间一般为60d(生存超过此时限者，仍按60d计算)。分别记录对照组和受试物组的平均生存时间。1.3.4.5白血病株的接种腹水型白血病如L1210及P388的接种同腹水型肿瘤接种法。L615小白鼠白血病的接种则按下述方法进行。取L615白血病小白鼠(约接种后第6d)，颈椎脱臼，在无菌条件下，剪取脾脏一小块(约米粒大小)，放置玻璃组织匀浆器内，加少量无菌生理盐水，制成细胞悬液，并稀释至89mL，取一定量加0.2%台盼蓝缓冲液，计每毫升悬液的活细胞数(台盼蓝终浓度为0.02%)。根据活细胞数值适当稀释悬液将细胞数调整至4107/mL，接种于小鼠皮下，每鼠接种细胞悬液0.10.2mL。1.4数据处理及结果判定采用方差分析进行统计，肿瘤模型对照组与受试物组比较，实体瘤瘤重或腹水瘤及白血病生存时间，经统计学处理差异有显著性，并且经两批动物重复试验验证，则可判定该受试物该项试验阳性。2动物诱发性肿瘤试验2.1原理动物通过化学诱导可形成与人体癌相类似的肿瘤模型，预先或同时给予受试物，观察其是否影响肿瘤发生率或瘤重或生存时间。2.2致癌物黄曲霉毒素B1初生小鼠肝癌甲基胆蒽小鼠肉瘤及皮肤癌二甲基肼大鼠结肠癌二甲基苯蒽大鼠乳腺癌N亚硝基甲基脲大鼠乳腺癌N二甲基亚硝胺大鼠肝、肺、肾脏肿瘤二乙基亚硝胺大鼠肝癌甲基亚硝基胍大鼠胃癌(只能灌胃)亚硝基肌氨酸大鼠食管/前胃癌亚硝基哌嗪大鼠鼻咽/鼻腔癌及其癌前期2.3实验方法2.3.1实验动物一般选择大白鼠或小白鼠，雌雄均可，根据致癌物诱癌的发生率决定动物的数量。2.3.2剂量分组设致癌物对照组，阴性对照组及3个受试物组。受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量，小鼠扩大10倍作为其中一个剂量，大鼠扩大5倍作为其中一个剂量。受试物经口给予，给予时间由致癌物对照组肿瘤发生的时间决定。2.3.3实验步骤致癌物对照组连续给予致癌物，阴性对照组给予溶剂，受试物组除给予致癌物外同时或预先给予受试物，试验结束，观察各组肿