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课题1菊花的组织培养 菊花的品种繁多 菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物 是我国的传统名花和世界四大切花之一 长期以来菊花采用分株 扦插等无性繁殖方法进行繁殖 但是传统的繁殖方法易受环境影响 繁殖周期长 随着市场需求的急剧增加 已经不能满足市场日益发展的需要 植物组织培养属于无性生殖中营养生殖营养生殖包括 扦插 嫁接 压条 植物组织培养 当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时 在一定的营养物质 激素 细胞分裂素 生长素 和其他外界条件 温度 pH 光照 无菌等 的作用下 就可能表现出全能性 发育成完整的植株 这种培育新植株的方法 叫做植物的组织培养 9 20世纪初 曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株 研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织 并在液体培养基中培养 使其分化出了愈伤组织 从愈伤组织又得到胚状体 胚状体转移到固体培养基上继续培养后 获得了完整的胡萝卜试管植株 经过栽培 此植株能够正常生长并开花结果 其种子繁衍出来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别无二致 根据此实验可以得出以下结论 即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株 由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因 故在一定条件下 它们均能发育成完整植株 这就是所谓的植物细胞全能性 植物组织培养发展简史 10 科学家在植物激素对器官建成 及改进培养基配方等方面所取得的成果 极大地推动了组织培养技术的发展 使这项技术可以实际应用于快速繁殖 品种改良等方面 20世纪50年代初期 法国科学家利用组织培养技术成功地脱除了染病大丽花植株所携带的病毒 从而为脱毒苗的生产提供了一种可行的途径 现在凭借组织培养技术来脱除植物的病毒已经在生产中广泛应用 20世纪50年代中期 由于细胞分裂素的发现 使组织培养状态下外植体芽的形态建成成为可人为调控的因素 从而使在组织培养状况下进行植株再生成为现实 进入60年代以后 组织培养技术在基础理论 实际操作方面不断取得进展 相继在植物体细胞杂交 单倍体育种 种质资源保存 快速育苗 人工种子制造 次生代谢物生产等方面有了可喜的成果 时至今日 组织培养技术已经成为基础坚实 易于掌握 应用面广的一种技术手段 一 植物组织培养的理论基础 概念 高度分化的植物细胞 仍然具有发育成完整新个体的潜能 基础 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有全套遗传物质 都有发育成为完整个体所必需的全部基因 因为它们都是由同一个受精卵细胞有丝分裂分化而来 基础知识 细胞全能性 12 细胞全能性的特点 高度分化的植物细胞在离体的情况下 在一定的营养物质 激素和其他适宜的外界条件下 才能表现其全能性 动物已分化的体细胞全能性受限制 但细胞核仍具有全能性 植物细胞要表现全能性 步骤 1 成熟细胞 分生细胞 胚状体 完整植株2 成熟细胞 愈伤组织 出根出芽 完整植株 13 需要条件 1 离体2 一定的营养物质3 植物激素 主要是生长素和细胞分裂素4 适宜温度和pH 细胞全能性大小 受精卵 生殖细胞 体细胞植物细胞 动物细胞分化程度低的细胞 分化程度高的细胞 植物组织培养过程 离体的植物器官组织或细胞 植物体 脱分化 细胞分裂 愈伤组织 芽 根 细胞分裂素 生长素 细胞分裂素 生长素 再分化 植物组织培养 不需要光 需要光 细胞分化 15 16 17 脱分化 由高度分化的植物器官 组织或细胞产生愈伤组织的过程 称为植物细胞的脱 去 分化 离体的植物组织或细胞 在培养了一段时间后 会通过细胞分裂 形成愈伤组织 方式 有丝分裂 脱分化就是有丝分裂的过程 愈伤组织 由离体的植物器官 组织或细胞 通过细胞分裂形成的细胞团 叫做愈伤组织 特点 细胞排列疏松而无规则 高度液泡化 呈无定形状态的薄壁细胞 19 再分化 由脱分化产生的愈伤组织重新分化形成根或芽等器官的过程 叫做再分化 再分化就是细胞分化过程 20 细胞分化 细胞分化 在植物的个体发育过程中 细胞在形态 结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 叫做细胞分化 细胞分化的特点 持久性 细胞分化贯穿于生物体整个生命进程中 在胚胎期达到最大限度 稳定性和不可逆性 一般来说 分化了的细胞将一直保持分化后的状态 直到死亡 普遍性 生物界普遍存在 是生物个体发育的基础 21 细胞分化的实质 在个体发育过程中 不同细胞中遗传信息的执行情况不同 即基因的选择性表达细胞分化的结果 在空间上细胞之间出现差异 在时间上同一细胞和它以前的状态有所不同 最终形成新的个体 22 细胞分化的意义 生物个体发育的基础 细胞分化使多细胞生物体中的细胞趋向专门化 有利于提高各种生理功能的效率 1 不同的植物 培养的难易程度差别很大 烟草和胡萝卜的组织培养较为容易 枸杞愈伤组织的芽诱导比较难 2 同一种植物材料的年龄 保存时间的长短等也会影响实验结果 菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 二 影响植物组织培养的因素 1 植物材料的影响 主要是大量元素和微量元素的影响 无机营养的影响 A 大量元素 N P K Ca Mg S等 B 微量元素 B Mn Cu Zn Fe Mo I Co等 其中 主要影响蛋白质 核酸的合成 K Ca Mg S主要影响酶的活性 主要是甘氨酸 烟酸 肌醇 维生素 蔗糖的影响 3 有机营养的影响 其中 蔗糖既是碳源也是调节渗透压的物质 维生素能促进细胞分裂和诱导器官分化 甘氨酸是蛋白质的组成成分 也是有机氮源 4 温度 光照 pH的影响 光照 菊花每日用日光灯照射12h 温度 大多数植物组织培养控制在23 27 低于15 时植物组织会表现生长停止 高于35 时对植物生长不利 菊花的组织培养控制在18 22 pH 不同植物对培养基最适pH的要求不同 大多数控制在5 6 5 菊花的组织培养控制在5 8左右 常用的植物激素 生长素 细胞分裂素是启动细胞分裂 脱分化和再分化的关键性激素 在生长素存在的情况下 细胞分裂素的作用呈加强的趋势 激素的使用顺序 使用量及比例影响植物细胞的发育方向 5 植物激素的影响 生长素 细胞分裂素和赤霉素 生长素类 2 4 二氯苯氧乙酸 2 4 D 吲哚乙酸 IAA 萘乙酸 NAA 吲哚丁酸 IBA 等 细胞分裂素类 激动素 KT 6 苄基嘌呤 6 BA 玉米素 ZT 等 赤霉素类 赤霉酸 GA3 等 作用 2 4 D有利于愈伤组织的生长 IAA NAA IBA有利于器官分化 作用 促进细胞的分裂与分化 其中KT能明显促进芽的分化而抑制根的形成 作用 促进不定芽和幼株伸长 有利于根的分化 抑制芽的形成 有利于芽的分化 抑制根的形成 促进愈伤组织的形成 激素的使用顺序 使用量及比例影响植物细胞的发育方向 先使用生长素 后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂 但不利分化 先使用细胞分裂素 后使用生长素 同时使用 细胞既分裂也分化 分化频率提高 菊花的组织培养程序 制备MS固体培养基 实验流程图 31 课外拓展 MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的 其特点是无机盐和离子浓度较高 是较稳定的离子平衡溶液 它的硝酸盐含量高 其养分的数量和比例合适 能满足植物细胞的营养和生理需要 因而适用范围比较广 多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基 基于此 这种培养基就用他们的名字来命名了 MS培养基主要成分 大量元素 N P K Ca S Mg等 微量元素 B Mn Cu Zn Fe Mo I Co等 有机物 甘氨酸 烟酸 肌醇 维生素 蔗糖等 植物激素 生长素 细胞分裂素 赤霉素等 33 34 微生物培养基的配方和MS培养基的配方相比 有哪些明显的不同 微生物培养基以有机营养为主 与微生物的培养不同 MS培养基则需提供大量无机营养 无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类 一 制备MS固体培养基 MS培养基包括20多种营养成分 实验室一般使用4 保存配制好的培养基母液来制备 1 配制各种母液 无机物中大量元素浓缩10倍 微量元素浓缩100倍 常温保存 激素类 维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg mL的质量浓度单独配制成母液 用母液配制培养基时 需要根据各种母液的浓缩倍数 计算用量 实验操作 2 配制培养基 分装到锥形瓶中 每瓶分装50mL或100mL 配制培养液 配制1LMS培养基时 先将称好的琼脂加入800mL蒸馏水 加热使琼脂熔化 然后加入蔗糖30g 取配制好的大量元素 微量元素 有机物和植物激素的母液 依次加入 加蒸馏水定容至1000mL 调pH 培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易 因此不必添加植物激素 3 灭菌 将分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌 1 选材 菊花茎段 取生长旺盛的嫩枝 二 外植体消毒 2 消毒 流水冲洗 菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉 用软刷轻轻刷洗 刷洗后在流水下冲洗20min左右 酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分 放入体积分数为70 的酒精中摇动2 3次 持续6 7s 立即将外植体取出 在无菌水中清洗 消毒液处理 取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分 放入质量分数为0 1 的氯化汞溶液中1 2min 取出后 在无菌水中至少清洗3次 漂净消毒液 外植体 用于离体培养的植物器官或组织片段 三 接种 接种前用体积分数为70 的酒精将工作台擦拭一遍 然后点燃酒精灯 因为污染的主要来源是空气中的细菌和孢子 1 接种室消毒 2 无菌操作要求 所有的接种操作都必须在酒精灯火焰旁完成 每次使用器械后 都需要用火焰灼烧灭菌 3 材料的切取和接种 将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成0 5 1cm的小段 用镊子夹取菊花茎段接种 4 接种注意事项 每接种一块外植体前 镊子需放入体积分数为70 的酒精溶液中消毒一次 然后在酒精灯火焰上烧一遍 冷却后再接种 外植体在培养基中要分布均匀 放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定 一般胡萝卜3 4块 菊花6 8块 也不要太少 以充分利用培养基中的营养成分和光照条件 插入时应注意茎段方向 形态学上端朝上 形态学下端朝下 不要倒插 茎段 茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分 四 培养 接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养 培养期间应定期消毒 培养温度控制在18 22 每日用日光灯光照12h 五 移栽 1 打开封口膜 移栽生根的菊花试管苗之前 应先打开培养瓶的封口膜 让试管苗在培养间生长几日 一般放置在20 25 的遮荫环境中 适应5 7d 试管苗不萎蔫 有新生长的趋势 便可移栽 2 清洗转移 用流水清洗根部的培养基 将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间 3 移栽 待幼苗长壮后再移栽到土壤中 珍珠岩 珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩 经急剧冷却而成的玻璃质岩石 有弧形或圆形裂隙 如珍珠的结构 所以被命名为珍珠岩 蛭石 是一种天然 无毒的矿物质 在高温作用下会膨胀的矿物 它是一种比较少见的矿物 属于硅酸盐 六 栽培 将幼苗移栽后 每天观察记录幼苗生长情况 适时浇水 施肥 直至开花 46 1 培养基的配置 要根据不同的材料 不同的物种 选择合适的培养基 最好有一组实验取得 做培养基的过程中注意调剂培养基的PH值 有些高温分解的激素要过滤灭菌等 2 培养材料的选择 需要选择生长较好材料 植物组织培养的注意事项 47 3严格无菌操作 无菌技术是植物组织培养获得成功关键 1 无菌技术包括对培养基 器械 和植物材料的灭菌消毒 对培养材料进行表面消毒时 一方面要考虑到要药剂消毒效果 另方面要考虑到植物材料的耐受性 2 妥善处理被污染培养物 3 有毒物质要妥善处理 以免造成环境污染 外植体可以用酒精消毒 操作前手需用酒精消毒 培养基需用高压蒸汽灭菌 48 4接种时注意 1 每接种一块外植体前 镊子要放入体积分数为70 的酒精中消毒一次 然后再酒精灯火焰上烧灼一遍 冷却后再接种 2 外植体在培养基重要分布均匀 以充分利用培养基中的营养成分和光照条件 3 插入时应注意方向 不要倒插 茎段茎尖基部插入培养基有利于吸收水分和养分 4 接种后几十个瓶盖好瓶盖 做好标记 写明接种材料 接种日期 5 培养条件的选择 包括光照 温度 湿度等 49 植物组织培养的优点 1 不受生长季节限制地繁殖植物 2 不携带病毒 3 培养周期短 4 可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品 5 可短时间大量繁殖 用于拯救濒危植物 6 可诱导之分化成需要的器官 如根和芽 7 解决有些植物产种子少或无的难题 如将香蕉进行组培得到人工种以方便移种 50 植物组织培养的用途 快速繁殖优良植物株系培育作物新品种获得无病植株保存和运输种质 CN geli认为在生殖细胞成分中可区别为二种 其中在雌雄两生殖细胞中等量存在的为遗传的基本物质称种质 而在雌性生殖细胞中多量存在的与营养有关的物质称营养质Er