鸡源大肠杆菌的分离与鉴定.doc

菏泽学院本科生毕业设计（论文）菏泽学院Heze University本科生毕业设计（论文）题目 鸡源大肠杆菌的分离与鉴定 姓名 学号 系 别 制药工程系 专业 动物医学 指导教师 职称 菏泽学院教务处制菏泽学院本科生毕业设计（论文）目 录摘要 1关键字 1Abstract 1Key words 1引言 21 材料与方法 31.1材料 31.1.1培养基及配制 31.1.2试验仪器31.1.3药敏纸片31.1.4生化发酵管31.1.5大肠杆菌O因子诊断血清41.1.6 试验动物41.2方法41.2.1病料采集41.2.2病原体分离41.2.3病原体的纯培养41.2.4革兰氏染色镜检41.2.5生化试验41.2.6 动物试验41.2.7 血清学鉴定51.2.8 药敏试验52 结果与分析52.1病菌的培养及镜检结果52.2 生化试验鉴定结果52.3 抗原测定结果52.4 动物试验结果52.5 药敏试验结果53 讨论6参考文献7致谢8鸡源大肠杆菌的分离与鉴定动物医学专业学生 指导教师 摘要：山东青岛即墨某鸡场所养雏鸡发生一种以败血症、高死亡率为特征的急性传染病，病鸡的临床症状多表现为精神萎靡，食欲减退或废绝，排白绿色稀粪等，剖检发现肝脏纤维素性炎症，呈铜绿色，脾充血、肿胀，心外膜水肿等。从病鸡中分离到一株致病菌，经细菌学检查和动物试验，确定该致病菌为大肠杆菌，抗原鉴定该菌的优势血清型为O78。环丙沙星、丁胺卡那、卡那霉素、新霉素、链霉素对该菌高敏；庆大霉素、罗红霉素对该菌中敏；对强力霉素、恩诺沙星对该菌低敏；对林可霉素、四环素、阿莫西林对该菌耐药。 关键词：鸡；大肠杆菌；分离与鉴定；药敏试验Isolation and Identification of E .coli from ChickenStudent Majoring in Veterinary Medicine Tutor Abstract:An acute infectious diseases characterized by high mortality rate and sepsis was occurrenced in Chicken farms of Jimi in Shandong province, most of the chickens showed clinical symptoms of listlessness,loss of appetite,evacuated white-green liquid manure,and pathological change was showed that liver was copper green with fibrinous inflammation,spleen was congestion and swelling,epicardium edema and so on.A strain was isolated from diseased chickens and was examined with bacteriology inspection and animal test,and the result shows that the strain is Escherichia coli,and the serotype of the bacterium is O78 by antigenic identification.The bacterium is high-sensitivity with Ciprofloxacin,kanamycin,neomycin and streptomycin,middle-sensitivity with Gentamicin and net-mycin,low-sensitivity with doxycycline and enrofloxacin,and drug resistance with lincomycin,tetracycline and amoxicillin. Key words:chicken;Escherichia coli;Isolation and Identification;susceptibility test1菏泽学院本科生毕业设计（论文）引言 鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的鸡的不同类型疾病的总称1，是一种急性或慢性的细菌性传染病。本病广泛发生与雏鸡、肉鸡、蛋鸡，临床症状复杂多变，较难防治，给养殖业带来严重危害，是影响养殖业的重要疾病之一。大肠杆菌是革兰阴性无芽孢的直杆菌，大小为0.4-0.7m2-3m ，两端钝圆，散在或成对2，有鞭毛，有的菌株可形成荚膜，易于在普通培养基上增殖，适应性强。本菌对一般消毒剂敏感，但粘液和粪便的存在会降低这些消毒剂的效果。本菌对抗生素等药物极易产生耐药性。在畜禽舍内，大肠杆菌在水、粪便和尘埃中可以存活数周或数月之久。 根据抗原结构不同，已知大肠杆菌有菌体（O）抗原170种，表面（K）抗原近103种，鞭毛（H）抗原60种，因而构成了许多血清型。在引起人畜肠道疾病的血清型中，有肠致病性大肠杆菌（简称EPEC）、肠产毒素性大肠杆菌（简称ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（简称EIEC）和肠出血性大肠杆菌（简称EHEC）等之分。在170种“o”型抗原血清型中约1/2左右对鸡有致病性，但最多的是O1、O2、O4、O11、O18、O26、 O78、O88等血清型3。本病一年四季均可发生，且不同地区的优势血清型往往有差别。在一些大型和个体养鸡场中，由于环境卫生条件较差，时常暴发鸡大肠杆菌病。由于鸡大肠杆菌血清型较多，且各地流行菌株不同，往往给本病的免疫预防带来许多困难。此外，由于临床上缺乏化验条件，生产上盲目滥用药物，造成大肠杆菌耐药菌株不断产生，致使该病治疗效果下降，给养鸡业造成了严重的经济损失4-8。雏鸡发病率可达30%-60%，病死率几乎达到100%。大型集约化养鸡场鸡群密度过大，通风换气不良，饲养用具及环境消毒不彻底可加速本病流行9。大肠杆菌随粪便排出，并可污染蛋壳，或大肠杆菌从感染的卵巢、输卵管等处侵入卵内，感染种蛋，是该病传播过程中的重要途径。健康鸡通过消化道采食被大肠杆菌污染的饲料和饮水或通过呼吸道吸入粘有大肠杆菌的尘埃可以造成水平传播。因此，预防本病十分重要，为使雏鸡获得被动免疫，可用本场流行的大肠杆菌血清型制备的多价活苗或灭活苗接种种禽。本病的发病类型较多，常见的有败血症、心包心肌炎、全眼球炎、关节滑膜炎、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、气囊炎和大肠杆菌性肉芽肿等。败血症大肠杆菌主要发生于6-8周龄的肉用仔鸡，但不满一周龄的雏鸡也可大批发病死亡。若在鸡群中有经蛋感染的幼雏，则其发病后排出毒力强的致病菌。通过消化道和呼吸道而发生水平传播，在短期内可造成大批幼雏发生败血性大肠杆菌病引起死亡。症状为极度萎靡，排白绿色稀粪。尸体剖检，在4月龄以上的仔鸡，除具一般败血症变化外，突出的病变是浆液性纤维素性心包炎、纤维素性肝周炎、纤维素性腹膜炎、纤维素性气囊炎、肠炎，脾充血、肿胀，肝呈铜绿色，实质内有白色坏死点。心包心肌炎型：浆液性纤维素性心包炎伴发心肌炎，通常是鸡败血症型大肠杆菌病的主要病变之一。但在中雏尤其是肉用仔鸡，有时以心包炎心肌炎为表现形式，病鸡呈亚急性经过，病鸡消瘦，贫血，逐渐衰竭死亡。尸体剖检，病变是心包炎和间质性心肌炎。心外膜水肿，并被覆淡黄色的纤维素性渗出物，心包呈不均匀的增厚，心包内充满淡黄色浆液和纤维素性渗出液。有些病例还有小化脓灶和肉芽肿样小结节。全球眼炎型：常发生于败血型流行后期，一般仅一个眼发炎，眼结膜充血、出血，眼前房和角膜混浊，随后失明。镜检可见，全眼都有异嗜性粒细胞和单核细胞浸润，脉络膜充血，视网膜完全破坏。关节滑膜炎型：多见于肩、膝关节。关节明显肿大，滑膜囊内有大量的灰白色或淡红色渗出物，关节周围组织充血水肿。卵黄性腹膜炎及输卵管炎型：本病发生于成年鸡，一般是散发性，俗称“蛋子瘟”。 本病可经泄殖腔上行感染，病禽腹泻，腹部肿胀，蹲伏，脱水，逐渐衰竭死亡。腹腔内充满腥臭的卵黄和凝固的卵黄块，腹腔内各脏器和肠系膜表面充血，有纤维素性渗出物附着，病程长者出现肠袢、内脏之间纤维素粘连。卵巢中的卵泡变性、瘪缩，呈灰色、酱色、褐色等。破裂的卵黄凝结成大小不一的团块。输卵管粘膜充血、出血，管腔内有蛋白和纤维素凝块，严重时，塞满凝固的蛋白和卵黄。脐炎型：主要发生于出壳不久的雏鸡，多见有脐环闭合不全，脐孔周围红肿，并常有皮肤破损、发硬，呈黄色，时间长者脐孔周围发红或呈紫黑色，后腹部肿大皮薄而发红或呈紫青色，拉黄白色或黄绿色稀粪，极为腥臭。病鸡全身衰竭，闭眼，垂翅，不愿走动，减食或废绝，出壳后最初几天死亡率较高。气囊炎型：气囊增厚，表面有纤维素渗出物被覆，呈灰白色，由此继发心包炎和肝周炎，心包膜和肝被膜上附有纤维素性伪膜，心包膜增厚，心包液增量、混浊，肝肿大，被膜增厚，被摸下散在大小不等的出血点和坏死灶。大肠杆菌性肉芽肿型：本病特征是肝、盲肠、十二指肠、肠系膜出现肉芽肿，一般为粟粒大至玉米粒大，切面灰黄色略呈放射状或轮层状，中央有脓点。该养鸡场发现多只病鸡，剖检观察，疑似大肠杆菌病。为准确诊断、治疗和预防，对该致病病原体进行分离鉴定。从病鸡体内分离该致病病原体后，通过一系列细菌学检查、动物接种试验及药敏试验，确定该病原体和敏感药物，为临床用药治疗大肠杆菌病和制备该血清型的多价灭活苗预防大肠杆菌病提供准确依据。1 材料与方法1.1 材料 1.1.1培养基及配制 营养琼脂培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂20g、NaCl 5g，将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，调节PH至7.4，分装试管，121高压蒸汽灭菌20min。麦康凯琼脂培养基：蛋白胨20g、猪胆盐5g、NaCl5g、琼脂17g、乳糖10g、0.1%结晶紫水溶液1ml、0.5%中性红水溶液5ml，将蛋白胨、猪胆盐和NaCl溶于400ml蒸馏水中，调节PH至7.2，将琼脂加热溶于600ml蒸馏水中，将两液合并，分装试管，121高压蒸汽灭菌15min。临用时，加热融化，趁热加入乳糖，冷却至50-55时，加入结晶紫和中性红水溶热，摇匀后倾注平板。三塘铁琼脂培养基：牛肉膏5g、蛋白胨20g、乳糖10g、蔗糖10g、葡萄糖1g、NaCl5g、硫酸亚铁铵0.2g、硫代硫酸钠0.2g、琼脂12g、0.2%酚红水溶液12.5ml，将上述成分除琼脂和酚红外溶于1000ml蒸馏水中，调节PH至7.4，加入琼脂，加热，溶化琼脂，加入0.2%酚红溶液，摇匀，分装试管，121高压蒸汽灭菌15min10。1.1.2 试验仪器高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、冰箱、常用玻璃仪器等。1.1.3药敏纸片12种药敏纸片:阿莫西林、链霉素、庆大霉素、强力霉素、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素、四环素、罗红霉素、林可霉素、环丙沙星、恩诺沙星，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产。1.1.4生化发酵管3菏泽学院本科生毕业设计（论文） 葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸橼酸盐、M-R试剂、V-P试剂等购自上海劲马科技有限公司。1.1.5 大肠杆菌O因子诊断血清O1、O2、O36、O78，4种O因子血清购自（北京）农业部中国兽药检查所细菌实验室。1.1.6 试验动物 30只该场的6日龄健康雏鸡。 1.2 方法1.2.1 病料采集病料来源于山东青岛某鸡场疑似大肠杆菌病发病雏鸡，无菌采集病鸡的肝脏、心内血作为病料。1.2.2病原体分离用接种环将病料直接划线接种于麦康凯琼脂平板上，37需氧培养24h。全过程无菌操作。1.2.3病原体的纯培养从麦康凯琼脂平板上挑取红色菌落的可疑病菌接种到营养琼脂培养基上，37需氧培养24h，再从营养琼脂培养基挑取单个菌落的病菌接种到营养琼脂培养基上，37培养24h，连续纯培养3代，得到病菌的纯培养物。全过程无菌操作。1.2.4革兰氏染色镜检取纯培养的病菌，革兰氏染色，在显微镜下观察病菌的形态特征。 1.2.5生化试验三糖铁琼脂试验：取纯培养的病菌接种于三糖铁琼脂斜面培养管内，37培养24h，观察结果。糖类发酵试验：取纯培养的病菌接种于糖类（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖）微量发酵管中，37培养24h，观察结果。吲哚试验：取纯培养的病菌接种于蛋白胨水培养液中，37培养3d。先加入少量乙醚，摇动试管以萃取和浓缩吲哚，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐徐加入欧-波二氏试剂数滴，观察结果。甲基红（M-R）试验：取纯培养的病菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养液中，37培养3d，加入甲基红试剂两滴，立即观察结果。V-P试验：取纯培养的病菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养液中，37培养3d，加入等量的V-P试剂（先加入V-P甲液，再加入V-P乙液），混匀后，观察结果。枸橼酸盐利用试验：取纯培养的病菌接种于枸橼酸盐斜面培养基上，37培养24h，观察结果。尿素分解试验：取纯培养的病菌接种于尿素培养基中，37培养24h，观察结果。H2S产生试验：取纯培养的病菌穿刺接种于H2S培养管中，37培养24h，观察结果。1.2.6动物试验 取纯培养的病菌接种于肉汤培养液中，37培24h。将30只健康雏鸡随机平均分成A、B两组，A组雏鸡腹腔注射0.2ml肉汤培养菌物，B组腹腔注射等量生理盐水作为对照试验，将两组分开，以免交叉感染，在适宜的环境中观察结果。1.2.7血清学鉴定用生理盐水将牛肉膏蛋白胨培养基上的病菌洗下，转移到1.5ml离心管中，10000r/min，离心5min。祛上清液，将沉淀用0.5ml生理盐水振荡混匀，10000r/min，离心5min，重复上述操作3次。再祛上清液，将沉淀用0.5ml生理盐水制成悬浊液，121高压蒸汽灭菌1h。取常见的O1、O2、O36、O78四种血清，分别滴于4片玻片上，再分取供试菌液50l与血清混匀，上下摇动玻片数次，3min内观察并判结果。同时，用生理盐水设立对照试验。1.2.8药敏试验挑取纯培养的单个菌落接种到营养肉汤中，37振摇培养24h。用灭菌的棉球蘸取致病菌的肉汤培养物，均匀涂布到牛肉膏蛋白胨琼脂平板的表面。再将庆大霉素、四环素、链霉素等10种常用的抗生素的药敏纸片贴到两个琼脂平板的表面，37培养24h后，测量抑菌圈的大小。2结果与分析2.1病菌的培养及镜检结果在麦康凯培养基的表面可见有表面光滑、边缘整齐、圆形隆起的红色菌落并分离到3株疑似大肠杆菌菌株。革兰氏染色镜检，视野中可见大量散在排列，形态均一，两端钝圆的革兰氏阴性红色短杆菌。2.2生化试验结果 表1生化鉴定结果实验项目结 果实验项目结果吲哚甲基红VP枸橼酸利用葡萄糖产气乳糖麦芽糖蔗糖H2S尿素酶TSI反应模式aVKA;aTSI（三糖铁培养基）上反应情况： A=产酸（黄色） K= 产碱（红色）；为阳性 为阴性 生化试验结果均符合大肠杆菌生化特性。2.3抗原测定结果玻片上的仅O78血清与试菌液发生了凝集，所以该大肠杆菌的O抗原为O78。2.4动物试验结果A组雏鸡6 h后开始出现症状，表现精神沉郁，食欲下降甚至废绝，不愿走动，多数出现腹泻，有的出现神经症状，头向后仰，两翅下垂。接种12h后开始出现死亡。对照鸡正常，无一例死亡。剖检死亡鸡，有心包液混浊，脑出血，肺充血、出血呈红色，脾肿大出血，肝周炎，气囊混浊及肠炎等典型大肠杆菌病病变，并从肝脏中回收到致病菌株。2.5药敏试验结果表2 药敏试验结果（mm）药物结果药物结果庆大霉素环丙沙星丁胺卡那卡那霉素四环素强力霉素1322252009恩诺沙星新霉素罗红霉素林可霉素阿莫西林 链霉素920120019注：抑菌圈直径大于15mm为高敏，直径在10-15mm为中敏，直径小于10mm为低敏、不敏感。5菏泽学院本科生毕业设计（论文） 药敏试验结果表明：该大肠杆菌对环丙沙星、丁胺卡那、卡那霉素、新霉素、链霉素高敏，抑菌圈直径达到了20mm左右；对庆大霉素、罗红霉素中敏；对强力霉素、恩诺沙星低敏；对林可霉素、四环素、阿莫西林耐药。3讨论致病性大肠杆菌是危害养殖业的重要病原菌，凡能引起机体抵抗力降低的各种因素，如饲养环境差、鸡舍阴暗潮湿、光照不足、通风不良、饲养密度大、鸡舍没有定期消毒及气候突变等因素均是引发本次疾病的原因，特别是各种病毒的感染，都可以诱发大肠杆菌病。因此良好的饲养管理条件和清洁的环境，避免和减轻应激反应对本病的预防会起到很大的作用。由于大肠杆菌在鸡舍、鸡体消化道广泛存在，且不同发病鸡场的大肠杆菌血清型可能不同及同一血清型的不同菌株在不同鸡场所表现的致病性也有差异，因此从发病鸡场的病死鸡体内分离到的大肠杆菌并不一定都具有致病性，必须进行致病性试验，确定分离菌株致病性的强弱，然后选择具有致病性的分离株研制针对不同发病鸡场的疫苗，进行免疫接种，才有可能有效预防不同发病鸡场的大肠杆菌病。抗菌药物在临床上广泛应用，大肠杆菌的耐药性不断增加。为避免细菌耐药性的产生，应先做细菌药敏试验，再合理选择用药，可缩短治疗时间，又避免滥用抗生素，同时减少养殖户的经济损失。针对雏鸡大肠杆菌病，可采取以下几方面的防治措施11：一是加强饲养管理：(1)保持适宜的温度：由于雏鸡对温度的要求很高，在育雏前3d，保证育雏室的温度达到3335，以后每周均匀地下降3，直到30d育雏期结束，使室温维持在182l左右。(2)保持适宜的湿度：育雏期间在供暖炉上适时蒸发点食醋或定期带鸡喷雾消毒(注意防疫期间决不可以带鸡消毒)。这样既可以保持空气湿润，又可保持地面干燥，效果很好。二是加强通风：保证温度的同时合理透风可以减少慢性呼吸道疾病的发生，同时也是防治大肠杆菌病的一个有力措施。 三是加强消毒：必须重视消毒和消毒效果，因此饲养时务必做到：(1)全进全出(2)空合期间的打扫卫生和25遍消毒；(3)上鸡之后对饲养管理人员尤其外来人员消毒，对水槽、料盆的消毒；(4)定期不定期的带鸡喷雾消毒(防疫期间除外)。参考文献1 林曦.家畜病理学M.3版.北京:中国农业出版社,1995: 24