红细胞裂解液法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞.doc

www.CRTER.org张卫东，等. 红细胞裂解液法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞红细胞裂解液法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞*张卫东，章方彪，史宏灿，谭荣邦，叶 钢，李广宇，潘 枢，孙 飞(扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225001)文章亮点：1 经红细胞裂解液处理后的骨髓液内含有大量的各种促进细胞生长的因子。红细胞及血小板的胞浆内含有丰富的促细胞生长因子，这些细胞因子可促进骨髓间充质干细胞成集落的簇状生长，为骨髓间充质干细胞的生长提供更适应的微环境，以利于骨髓间充质干细胞的增殖。2 经红细胞裂解液处理后，骨髓液内细胞杂质明显减少，通过离心纯化，可以得到纯度更高的含有骨髓间充质干细胞的骨髓液，进而可以明显较少骨髓间充质干细胞的原代培养时间，提高骨髓间充质干细胞的增殖速度。3 实验发现经红细胞裂解液处理后，早期骨髓间充质干细胞的贴壁细胞数量明显较未经红细胞裂解液处理所获得的数量多。关键词：干细胞；骨髓干细胞；骨髓间充质干细胞；红细胞裂解液；细胞培养；分离纯化；细胞增殖；细胞生物学；国家自然科学基金；干细胞图片文章主题词：干细胞；间质干细胞；细胞，培养的；细胞增殖基金资助：国家自然科学基金(30672080，30972968，81170014)*；江苏省“六大人才高峰”高层次人才基金(2009128) *；江苏省“青蓝工程”学术带头人基金(20081215)资助*摘要背景：有研究向骨髓液中加入红细胞裂解液来提高分离纯化骨髓间充质干细胞的效率，以期获得纯度高、数量多的骨髓间充质干细胞。目的：进一步验证红细胞裂解液法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的增殖特性，并对其进行细胞生物学鉴定。方法：使用红细胞裂解液提取含有兔骨髓间充质干细胞的骨髓悬混液，于4，7，10，13 d记录比较原代细胞的生长相对数量；观察传代细胞的生长情况，绘出P2、P3、P4及P5代细胞的生长曲线，比较各代细胞的增殖特点；倒置相差显微镜观察细胞的形态，细胞免疫荧光及流式细胞仪检测所获得细胞的CD44、CD34表面抗原的表达情况。结果与结论：红细胞裂解液法所获得的兔骨髓间充质干细胞为均一规则的以梭形为主的贴壁细胞，其胞核胞核均质、核仁明显、胞浆丰富，且CD44抗原表达阳性、CD34抗原表达阴性；原代细胞生长曲线呈类“S”型；P4代细胞具有较好的增殖活性，其生长速度、所获取的细胞数量均优于其他代数细胞。说明红细胞裂解液法可以在体外较好的培养出骨髓间充质干细胞，其P4代细胞是骨髓间充质干细胞增殖能力最强的一代细胞。Red blood cell lysis isolation and culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells in vitro Zhang Wei-dong, Zhang Fang-biao, Shi Hong-can, Tan Rong-bang, Ye Gang, Li Guang-yu, Pan Shu, Sun Fei (Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China)张卫东，男，1988年生，河南省驻马店市人，汉族，扬州大学在读硕士，主要从事组织工程气管构建的研究。Z 通讯作者：史宏灿，博士，主任医师，博士生导师，扬州大学临床医学院，江苏省扬州市 225001中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2013)49-08468-06修回日期：2013-09-14(201305061/WW)Zhang Wei-dong, Studying for masters degree, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, ChinaZCorresponding author: Shi Hong-can, M.D., Chief physician, Doctoral supervisor, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China Accepted: 2013-09-14AbstractBACKGROUND: Some studies have demonstrated that red blood cell lysate added into the bone marrow can increase the efficiency of isolating and purifying mesenchymal stem cells, in order to obtain high-purity and high-quantity bone marrow mesenchymal stem cells.OBJECTIVE: To isolate and culture bone marrow mesenchymal stem cells of rabbit with red blood cell lysis in vitro for exploring proliferation characteristics and performing the biological identification of cells. METHODS: Bone marrow suspension was collected by puncturing the tibia with medullo-puncture needle. Red blood cell lysis was added to the bone marrow suspension, and bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured. Numbers of primary cells were recorded at 4, 7, 10, and 13 days later And Growth curves of the cells at passages 2-5 were drawn for comparison of proliferative characteristics. Inverted phase contrast microscope was used to observe the morphological changes of cells. CD34, CD44 antigens of bone marrow mesenchymal stem cells were identified by flow cytometry and immunity fluorescence. RESULTS AND CONCLUSION: The adherent bone marrow mesenchymal stem cells mainly showed s spindle 8469 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 shape, with homogeneous nuclei, prominent nucleoli, and rich cytoplasm, which were positive for CD44 antigen and negative for CD34 antigen. The primary cells exhibited an “S” shape. Passage 4 cells had a better proliferative ability, rapider growth and more counting of cells as compared with other generations. These findings indicate that red blood cell lysis method is a feasible ways of culturing bone marrow mesenchymal stem cells 0 in vitro, and passage 4 cells have the strongest proliferation capacity.Subject headings: stem cells; mesenchymal stem cells; cells, cultured; cell proliferationFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 30672080*, 30972968*, 81170014*; the High-level Personnel Fund for the “Six Talents Peak” of Jiangsu Province, No. 2009128*; Jiangsu Province “Blue Project” Academic Leaders Fund, No. 20081215*Zhang WD, Zhang FB, Shi HC, Tan RB, Ye G, Li GY, Pan S, Sun F. Red blood cell lysis isolation and culture of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(49):8468-8473. 8473ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction骨髓间充质干细胞是存在于骨髓腔内具有很强增殖能力及多向分化潜能的一类成体干细胞1，在一定条件下其不仅可以分化为同源于中胚层的间质细胞，还可以诱导分化为骨细胞2、软骨细胞3、脂肪细胞4、上皮样细胞5、心肌细胞6、肝细胞等7。近年来随着组织工程技术的快速发展，骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及其增殖特性的相关研究逐渐受到越来越多研究人员的关注。目前，骨髓间充质干细胞常用的分离培养方法有全贴壁筛选培养法、密度梯度离心法和流式细胞仪分离法等8，由于骨髓液中存在大量的红细胞，近几年开始有人向骨髓液中加入红细胞裂解液来提高分离纯化骨髓间充质干细胞的效率，以期获得纯度高、数量多的骨髓间充质干细胞9。实验探索了如何通过红细胞裂解液法获得骨髓间充质干细胞，及骨髓间充质干细胞各代细胞的增殖能力。1 材料和方法 Materials and methods设计：细胞学体外实验。时间及地点：实验与2012年3至9月在扬州大学转化医学研究中心完成。材料：红细胞裂解液法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞实验所需试剂及仪器：试剂及仪器Bioss公司，北京HyClone公司，美国浙江天杭生物科技有限公司碧云天生物公司武汉博士德生物工程有限公司Sigma公司，美国Olympus公司，日本Thermo公司，美国BioTek公司，美国BD公司，美国鼠抗兔抗CD44-PE、CD34-PE、IgG-PE抗体DMEM/F12培养基胎牛血清红细胞裂解液DAB显色试剂盒、苏木精-伊红染色试剂盒0.5%Triton X-100、MTT、二甲基亚砜正置显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜恒温培养箱、离心机酶联免疫检测仪流式细胞仪 来源实验动物：新西兰大白兔1只，雌雄不拘，4周龄，平均体质量750 g，由扬州大学医学院动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。实验方法：骨髓间充质干细胞的获取：取25%乌来糖以4 mL/kg麻醉新西兰大白兔，固定、备皮、消毒，取兔的胫骨，碘伏浸泡10 min，无菌PBS冲洗2次，从两边干骺端剪断，用含有肝素的PBS冲洗髓腔，获得10 mL的冲洗液，装入15 mL离心管内。细胞分离与原代培养：将离心管置入离心机内，以 1 000 r/min离心5 min，弃上清，剩余沉淀约0.5 mL，加红细胞裂解液至3 mL，持续振荡5 min左右，当离心管内液体逐渐变为红色，添加10 mL PBS，再次1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次，加DMEM/F12培养液(含体积分数10%胎牛血清)重悬细胞。将离心管内的细胞悬液用吸管均匀混合，接种入4块96孔板中，每块板种植8孔细胞，0.2 mL/孔，四周设空白对照。剩余细胞悬混液种植入75 mL的细胞培养瓶内。将以上96孔板及细胞培养瓶均放入37 、体积分数5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中，孵育48 h后全部首次换液。换液时用吸管吸去上层未贴壁悬浮细胞，并各取适量PBS洗去未贴壁细胞，加新鲜培养基继续培养，以后每两三天换液1次。每日倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，并留取照片。原代细胞生长曲线的绘制：分别于4，7，10，13 d取上述4块96孔板中的一块在酶联免疫检测仪上检测各孔A490 nm值，共测32次，并记录，以备分析。细胞传代培养及细胞爬片的制作：待上述培养瓶内的细胞生长至接近80%融合时，给予消化传代。弃去上清液，PBS清洗2次，滴加2.5 g/L胰酶1 mL，1.0-2.0 min，显微镜下可见细胞回缩变圆，即添加含有血清的培养基终止消化，吹打混匀，1 000 r/min离心5 min去除胰酶，PBS洗涤1次，加入新鲜DMEM/F12培养液(含体积分数为10%胎牛血清)重悬细胞，以12比例接种细胞培养瓶传代。每日用倒置相差显微镜观察细胞的活力和增殖情况。将经过灭菌的玻片小心铺于无菌培养皿内，取第3代生长良好的细胞悬液用吸管滴加几滴于玻片上，盖好培养皿后置于恒温培养箱中，孵育12 h后取出玻片进行苏木精-伊红染色及免疫荧光鉴定。传代细胞生长曲线的绘制：用MTT法测定P2、P3、P4及P5代细胞的生长曲线10：分别取传至P2、P3、P4、P5代的细胞培养瓶，经2.5 g/L胰酶消化后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度，以3 000/孔种植于10块96孔板中，每代细胞接种8孔，并在四周设空白对照孔，置于37 、体积分数为5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中孵育。在1-10 d内，每天同一时间分别取一块96孔板，取出后向每孔内加入5 g/L 的MTT溶液20 L，置于恒温培养箱内培养4 h，然后取出吸去孔内上清液，向每孔中加入 150 L二甲基亚砜，于水平振荡摇床上缓慢匀速振荡10-15 min，酶联免疫检测仪下测定每孔的A490 nm值。骨髓间充质干细胞的鉴定：形态学观察与苏木精-伊红染色：倒置显微镜下，每日观察原代及传代细胞的形态。利用已制作的细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定90 min，PBS漂洗3次2 min，滴加苏木精覆盖标本，染色3 min左右，自来水洗涤，将爬片浸入体积分数95%乙醇30 s，然后滴加伊红1 min左右，自来水洗涤，观片。细胞免疫荧光检测：利用已制作的细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定90 min，PBS漂洗3次2 min，0.5%Triton X-100 37 孵育20 min，PBS漂洗2次5 min，滴加1%BSA，37 孵育30 min，甩去多余液体，直接滴加含有荧光素的鼠抗兔抗体(抗CD34-PE、抗CD44-PE)，4 过夜，PBS漂洗2次2 min，留少量PBS观片。流式细胞仪鉴定：利用上述细胞瓶内经2.5 g/L胰酶消化制备成单细胞悬液的P3代细胞，转移入离心管内，1 000 r/min，离心5 min。弃上清液，调整细胞浓度，移入4个流式管内，每管细胞约1106个，分别向4个流式管内加入抗CD34-PE、抗CD44-PE、同型对照IgG-PE及空白对照PBS各10 L，常温孵育30 min，加PBS洗涤1次，2 000 r/min，离心10 min，弃上清液，后加入300 L PBS混匀，放入流式细胞仪内检测。主要观察指标：骨髓间充质干细胞的鉴定。原代细胞生长曲线的分析。传代细胞的生长曲线分析。统计学分析：应用SPSS 18.0软件进行统计学处理分析，计量资料采用t 检验，分别运用单因素方差分析4代细胞之间的差异比较，P 0.05认为差异有显著性意义。 2 结果 Results2.1 骨髓间充质干细胞的鉴定 见图1。 GF100 m100 m100 mBCDA100 m100 m100 mA：细胞接种6 hB：细胞培养24 hJIK100 m100 mEH100 m50 m50 mA：细胞接种6 h(注：可见到较少量的贴壁细胞)；B：细胞培养24 h(注：可清晰的见到梭形贴壁细胞，且呈簇状生长，同时培养瓶内仍充满大量的红细胞等杂质细胞)；C：细胞生长至2 d(注：明显可见细胞成簇状聚集生长的现象，其形态多样，有梭形、三角形、不规则形等，细胞排列杂乱无序)；D：细胞生长至第6天(注：培养瓶内的杂质细胞基本被清除，培养瓶内仅有单一的簇状生长的细胞)；E：细胞生长至10 d时(细胞融合接近80%)；F：细胞生长至13 d(注：细胞融合接近100 %，此时培养瓶内的细胞基本为形态单一的梭形，排列较为规则有序)；G：细胞生长至15 d(注：可见到细胞明显萎缩，其间隙变大，形态不规则，显示为老化状态)；H：经过传代的细胞在6 h(注：开始有少量细胞贴壁)；I：传代细胞生长至1 d时(细胞贴壁率明显提高，可看到大量的贴壁细胞)；J：传代细胞在10 d(融合接近100%)；K：培养细胞经苏木精-伊红染色显微镜下观察(注：可见到胞核为蓝色，胞质为紫红色，细胞形态清晰直观，胞核均质，核仁明显，胞浆丰富)图1 红细胞裂解液法培养兔骨髓提取的细胞形态学观察结果Figure 1 Morphology of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells cultured using red blood cell lysis method形态学观察与苏木精-伊红染色：刚接种入细胞培养瓶内，细胞悬液中主要以小圆点形红细胞为主，有少量的单个核细胞。恒温培养箱内培养6 h即可见到较少量的贴壁细胞，见图1A。24 h左右时可清晰的见到梭形贴壁细胞，且呈簇状生长，同时培养瓶内仍充满大量的红细胞等杂质细胞，见图1B。2 d后经过换液，培养瓶内的杂质细胞大部分被清除，此时可更加明显的看到细胞成簇状聚集生长的现象，其形态多样，有梭形、三角形、不规则形等，细胞排列杂乱无序，见图1C。经过2次换液，第6天时细胞培养瓶内的杂质细胞基本被清除，培养瓶内仅有单一的簇状生长的细胞，见图1D。当细胞生长至10 d时，细胞融合接近80%，见图1E。细胞生长至13 d时，细胞融合接近100%，此时培养瓶内的细胞基本为形态单一的梭形，排列较为规则有序，见图1F。当细胞生长至15 d左右时，可见到细胞明显萎缩，其间隙变大，形态不规则，显示为老化状态，见图1G。经过传代的细胞在6 h左右即开始有少量细胞贴壁，见图1H。传代细胞生长至1 d时，其细胞贴壁率明显提高，可看到大量的贴壁细胞，见图1I。在10 d左右融合接近100%，见图1J。苏木精-伊红染色后显微镜下可见到胞核为蓝色，胞质为紫红色的细胞，此时细胞形态更清晰直观，胞核均质，核仁明显，胞浆丰富，见图1K。细胞免疫荧光：细胞免疫荧光显示标记抗CD44-PE的细胞呈现出的绿色荧光遍及整个细胞表面，标记抗CD34-PE的细胞显示棕褐色，未见绿色荧光显示，见图2，提示该细胞CD44抗原表达阳性，CD34抗原表达阴性。注：标记抗CD44-PE的细胞呈现出的绿色荧光遍及整个细胞表面。B：标记抗CD34-PE的细胞A：标记抗CD44-PE的细胞注：标记抗CD34-PE的细胞显示棕褐色，未见绿色荧光显示。图2 红细胞裂解液法培养兔骨髓提取的细胞免疫荧光检测结果(200)Figure 2 Immunofluorescence test results of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells cultured using red blood cell lysis method (200)流式细胞仪分析：经流式细胞仪分析显示所培养的细胞有95.57%表达CD44抗原，而表达CD34抗原的细胞仅有1.83%，见图3。注：所培养细胞抗CD34抗体阳性表达1.83%，抗CD44抗体阳性表达95.57%，符合骨髓间充质干细胞的生物学特性。图3 红细胞裂解液法培养兔骨髓提取的细胞流式细胞仪分析Figure 3 Flow cytometry analysis of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells cultured using red blood cell lysis method2.2 原代细胞生长曲线的分析 于4，7，10，13 d取上述4块96孔板中的一块在酶联免疫检测仪上检测各孔A490 nm值，共8孔4次，取其平均值，进行比较分析。结果发现，红细胞裂解液培养法所获得的原代细胞约 24 h左右已有部分细胞贴壁，其对数生长期在4-10 d，生长曲线类“S”形；7-10 d融合接近80%，13 d融合接近100%，此后进入生长停滞期。见图4。0.104培养时间(d)注：原代骨髓间充质干细胞对数生长期在4-10 d，其生长曲线类“S”形；13 d后进入生长停滞期。A 490 nm值1013图4 红细胞裂解液法培养的原代骨髓间充质干细胞的生长曲线Figure 4 Growth curve of primary bone marrow mesenchymal stem cells cultured using red blood cell lysis method2.3 传代细胞的生长曲线分析 据测得的P2，P3，P4，P5代细胞在1-10 d的A490 nm值描绘出该细胞的生长曲线，见图5。传代细胞的生长潜伏期在一两天，对数生长期在3-7 d，其后进入增殖平台期，其生长曲线为类“S”形，第9天左右融合接近100%，进入生长停滞期；其中P4代细胞是骨髓间充质干细胞增殖能力最强的一代细胞(P 0.05)，其生长速度、所获取的细胞数量均优于相同条件下的其他代数细胞。P2P3P4P0.20.10A 490 nm值培养时间(d)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10P4代细胞与其他代数细胞比较，P 0.05。注：P4代细胞是骨髓间充质干细胞增殖能力最强的一代细胞。图5 红细胞裂解液法培养的P2，P3，P4，P5骨髓间充质干细胞的生长曲线 Figure 5 Growth curves of bone marrow mesenchymal stem cells at passages 2-5 cultured using red blood cell lysis method3 讨论 Discussion骨髓间充质干细胞在治疗各种骨缺损11、神经脊髓损伤12-14、心肌梗死缺血15、促进坏死组织的愈合等细胞修复领域越来越多的被各种实验研究所报道，其应用潜力巨大。但由于骨髓液中含有的骨髓间充质干细胞等单个核细胞的比例不足十万分之一的数量级，所以成熟、简便、高效的分离纯化出具有增殖活性较好、生长特点稳定的骨髓间充质干细胞是组织工程实验的关键步骤。骨髓间充质干细胞的常用分离纯化方法有全骨髓贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法以及免疫磁珠分离法等，其中流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法分离效果较好，纯度较高，但是其成本较大，操作较复杂故而难以大规模推广使用16。红细胞裂解液法是在全骨髓贴壁筛选法基础之上优化而来，其提前在全骨髓贴壁筛选法的待处理骨髓液中加入一定量的红细胞裂解液，去除骨髓液中较大数量级的无核红细胞及血小板，进而分离纯化出骨髓间充质干细胞的一种细胞培养方法17。实验所使用红细胞裂解液的有效成分是氯化铵(NH4Cl)，骨髓液中含有大量的无核细胞及有核细胞，两种细胞的渗透脆性具有明显的差异，红细胞裂解液利用二者渗透脆性的差异性可独特的破坏无核红细胞及血小板的胞膜，致大量的无核红细胞及血小板裂解，使骨髓液纯化为仅剩有带核细胞的溶液，且这一过程并不破坏淋巴细胞及其他有核细胞,同时利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性,通过定期冲洗换液进而更易分离培养出骨髓间充质干细胞18。红细胞裂解液法分离纯化骨髓间充质干细胞，有以下优点：经红细胞裂解液处理后的骨髓液内含有大量各种促进细胞生长的因子9,18。红细胞及血小板的胞浆内含有丰富的促细胞生长因子，这些细胞因子可促进骨髓间充质干细胞的成集落的簇状生长，为骨髓间充质干细胞的生长提供更适应的微环境，以利于骨髓间充质干细胞的增殖19。增加骨髓间充质干细胞的浓度，提高骨髓间充质干细胞的增殖速度。经红细胞裂解液处理后，骨髓液内细胞杂质明显减少，通过离心纯化，可以得到纯度更高的含有骨髓间充质干细胞的骨髓液，进而可以明显较少骨髓间充质干细胞的原代培养时间，提高骨髓间充质干细胞的增殖速度9。早期促进骨髓间充质干细胞的贴壁。实验发现经红细胞裂解液处理后，早期骨髓间充质干细胞的贴壁细胞数量明显较未经红细胞裂解液处理所获得的数量多。可能的原因为经红细胞裂解液处理后骨髓液内红细胞及血小板数量极少，影响骨髓间充质干细胞贴壁的杂质相对减少，为骨髓间充质干细胞贴壁保留出更多的空间，利于骨髓间充质干细胞的早期贴壁20。实验所采用的红细胞裂解液法所培养出的骨髓间充质干细胞在生长至13 d左右时细胞成典型的长梭形，排列规则均一，几乎无其他杂质细胞存在，细胞融合接近100%；经传代细胞培养比较不同代数细胞生长曲线时，发现P4代细胞具有最强的增殖活性，适宜于进一步的实验研究；通过细胞免疫荧光及流式细胞仪鉴定所培养的细胞表面分子CD44表达阳性，CD34表达阴性，符合骨髓间充质干细胞的细胞生物学特 性21-22。故红细胞裂解液法也能够分离出高纯度的骨髓间充质干细胞，其具有稳定的生物学活性，较好的增殖活性，是一种操作简便、易于复制的骨髓间充质干细胞分离方法。作者贡献：实验设计、评估由张卫东、章方彪、史宏灿完成，实验实施由张卫东、章方彪、潘枢、孙飞完成，资料收集谭荣邦、叶钢、李广宇完成，史宏灿审校，张卫东对本文负责。利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。学术术语：红细胞裂解液-是一种去除红细胞最简便易行的方法，即用裂解液裂解红细胞，它既不损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法，主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。4 参考文献 References1 Jones E,McGonagle D.Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo. 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