第十章 细胞培养.doc

第十章 细胞培养目的要求：1.掌握得到单细胞无性系的技术；2.掌握细胞培养的方法，其含义及特点；3.学会小细胞团的计数方法；4.了解影响单细胞培养的因子；5.掌握细胞悬浮培养的方法：成批培养；连续培养；6.理解细胞悬浮培养的应用。教学难点、重点：单细胞培养和细胞悬浮培养的方法。第一节 单细胞培养一、单细胞的分离1.愈伤组织诱导不同的植物彩用不同的方法用不同的外植体诱导形成愈伤组织。愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。2.单细胞悬浮液的制备将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物，进而通过振荡培养，使愈伤组织形成细胞团，小细胞团甚至是单细胞分散培养物，再进一步通过细胞筛过筛得到单细胞悬液。二、单细胞培养的方法（一）平板培养法是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。用于分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。该法的特点为：可以定点观察；分离单细胞系容易；但培养细胞气体交换不畅。平板培养的基本技术：1）单细胞悬浮液的制备2）悬浮细胞密度的调制平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为110 10010 个/ml 。初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。若悬浮液与培养基以1:4混合，则应把悬浮液的细胞密度调到 510 - 50010 个/ml。3）琼脂培养基配制 1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液 = 0.7 %琼脂条件培养基。4）平板制作细胞悬浮液与融化状态（35 ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。5) 培养26置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。（二）看护培养法指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。可诱导形成单细胞培养系。Muir（1954）首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp（1972）成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。基本操作步骤为：1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。4）恒温培养。此法简便易行，效果好，易于成功。但是不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 （三）微室培养法即将细胞培养在很少量的培养基中。在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。1）微室内不能有气泡。2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片 的厚度要在0.170.18毫米左右。3）观察时要保持温度和培养时的一致。第二节 细胞悬浮培养细胞悬浮培养是将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。特点：1）细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。一、培养类型和方法（一）成批培养含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生 长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。1.成批培养的特点培养基体积固定；必须适当搅拌；培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长；但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。2.成批培养的方法1）旋转培养2）往返震荡培养3）旋转震荡培养4)搅动培养（二）连续培养含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。1.连续培养的特点1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应。2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中。3）适于大规模工业化生产。2.连续培养的种类1）半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液2）连续培养：封闭式和开放式3.连续培养的方法1）浊度恒定法这是根据悬浮液混浊度的提高来注入新鲜培养液的开放式连续培养。可以人为地选定一种细胞密度，用混浊度法控制细胞密度，此法敏感度提高。2）化学恒定法这是按照某一固定速度，随培养液一起加入对细胞生长起限制作用的某种营养物质，使细胞增长速率和细胞密度保持恒定的一种开放式连续培养法。二、培养基的同步化1.同步化饥饿2.同步化移植3.同步化分选三、培养基的振荡1.旋转式摇床2.慢速转床3.自旋式培养架四、培养细胞的生长和活力测定（一）培养细胞生长的测定1.细胞计数 5%铬酸或0.25%果胶酶使悬浮细胞团分散用血球计数板进行。2.细胞密实体积（PCV） 将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15ml 的离心管中，2000转下离心，用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。3.细胞鲜重和干重（二）培养细胞活力的测定：1.TTC法（2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑） 在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取分光光度计检测。2.FDA法（荧光素双醋酸酯法）FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。荧光素在死细胞中不能积累。在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。3.伊凡蓝法4.相差显微术法 观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、核存在表明有活力；五、影响细胞培养的因子1.条件培养基条件培养基可有利于单细胞的生长与分裂2.细胞密度临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。一般要求每毫升在1000个细胞以上。3.生长物质生长激素加1种细胞分裂素和几种氨基酸。临界密度只需25-30细胞/毫升。4.pH5.CO2六、细胞悬浮培养的应用（一）植物有用物质的生产在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物。1.技术难关目前，培养细胞工业化生产仍存在相当大的困难，有以下几个关键问题：1）缩短生产周期、降低生产成本2）提高培养细胞中的有效成分含量3）防止细胞集聚成块4）防止细胞株种性退化和变异2.发酵罐培养方法1）选择培养基2）细胞株建立 愈伤组织的诱导和培养单细胞分离细胞无性系分离细胞株的筛选3）扩大培养4）大罐发酵培养5）固定细胞培养法（二）诱发和筛选突变体在细胞培养过程中会产生一些突变体，常采用不同培养基来进行选择，也就是把悬浮细胞培养于缺少某种营养物质或生长因子，或是添加某种抑制剂的培养基里，使突变细胞和正常细胞区别开来（三）用于原生质体培养和细胞器分离利用