化工专业实验-蛋白质的离子交换层析分离实验-2013.doc

化工专业实验 蛋白质的离子交换层析实验一、实验目的 1了解离子交换层析分离蛋白质的基本原理。2掌握离子交换层析分离操作的基本步骤及方法。二、实验原理1. 离子交换层析蛋白质的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析分离方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成，带负电荷能吸附正电荷的称之阳离子交换树脂，而带有正电荷能吸附负电荷的称之阴离子交换树脂。蛋白质（protein）是生命的物质基础，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的生物大分子物质。蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的。虽然蛋白质是大分子有机物，但由于蛋白质中含有氨基、羧基等亲水基团，蛋白质长链中的亲水基团向外而疏水基团向内，可以形成特定的三维结构，所以大部分蛋白质仍能较好的溶解在水溶液中。在一定的离子强度范围内，溶液中的小分子离子在静电作用下吸附包裹在蛋白质表面亲水基团外侧，形成双电层结构，一定程度上有助于稳定蛋白结构及其水溶性。但蛋白质在不同的pH条件下，其带电状况不同。当pH较低时，蛋白质表面正电荷多于负电荷，总体电性为正；当pH较高时，蛋白质表面正电荷少于负电荷，总体电性为负；当蛋白质表面正电荷量与负电荷量相当时，蛋白质总体显示电中性，双点层结构解体，蛋白质亲水性降到最低，将表现出明显的疏水性，发生疏水性团聚和沉淀，此时的pH值即为蛋白质的等电点。不同蛋白质结构不同，等电点亦不同，但大部分已知蛋白多属于阴离子蛋白，在中性溶液中显示出电负性。离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化：阴离子交换基质能吸附带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质能结合带有正电荷的蛋白质。一般而言，pH越低，蛋白质净正电荷数越多，pH越高，蛋白质净负电荷数越多；蛋白质分子个头越小，净电荷数越多，离子交换吸附作用越强，越难被洗脱；溶液中小分子离子含量越多，蛋白质可吸附量越少，但若小分子离子含量过低，蛋白质双电层结构不易形成，其水溶性会降低。因此，可以通过提高洗脱液中的盐浓度或改变pH值等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。2.离子交换层析分离蛋白质的过程与步骤本实验将采用强碱性大孔树脂吸附分离牛血清白蛋白（BSA），实验装置结构如图所示。离子交换层析操作一般分为五步：（1）平衡：用操作条件下的背景缓冲液平衡层析柱，使介质柱中溶液环境体系各处均一，与吸附上样样品的背景溶液条件相同；（2）上样：将待分离原料连续稳定的注入层析柱中进行吸附分离，未被吸附的物料将从层析柱下端排出；随上样时间的增加，层析介质的吸附量将逐渐增大并趋于饱和，出口浓度也将不断增加直至与上样浓度相同。待吸附上样物料未被吸附而从出口排出，称为穿透。（3）冲洗：用背景缓冲液冲洗层析系统，排出管路及层析柱床空隙中未吸附的物料；若在该溶液环境条件下原料与吸附介质间的吸附作用力较弱，则冲洗操作会造成部分解吸。（4）洗脱：用特定pH值的含盐缓冲液冲洗层析柱，解吸柱内的蛋白质；（5）再生：用再生溶液冲洗层析柱，彻底清除未解吸的吸附物料，再生还原层析介质，以备后用。3. 物料恒算若收集上样和冲洗过程的穿透液，根据物料守恒，应有：上样量=穿透量+吸附量若上样浓度为C0，上样体积为V0，层析洗脱死体积为VS，介质质量为m，单位质量介质的吸附量为qm,穿透液体积为VT，穿透液平均浓度为CT，则有：进而，可计算出介质最终的吸附密度： （1）吸附回收率R1为 （2）不同洗脱溶液的解吸附效果不同，若洗脱过程穿透液的平均浓度为CX，体积为VX，则此时的洗脱回收率R2为： （3）层析分离操作的总收率R3为： （4）4.蛋白含量的测定在无其他杂质干扰的情况下，蛋白质含量可采用紫外光吸收法进行定量，绝大部分蛋白质对280nm紫外光有明显的吸收，通过测定样品的吸光度与标准曲线比对，即可确定样品中的蛋白含量。三、实验装置实验装置包括恒流泵、层析柱、上样瓶、收集瓶及连接管路组成。操作状态下，样品瓶中的样品沿连接管路被恒流泵输送到层析柱，由层析柱上端进入介质床层，再由层析柱下端流出至收集瓶。实验操作过程中应当防止气泡进入层析柱，切换上样样品时需停泵，尽量避免气泡进入管路，否则，气体易滞留于介质床层中，影响液-固间物质传递。四、实验步骤1.层析柱准备首先，称取2g强碱性大孔树脂，装入层析柱；然后，连接好管线，开泵向层析柱内输入去离子水，排出输入管线中的气体；调节层析柱上端转接头排出介质柱床中的气体，使转接头下缘紧贴介质床层上沿，旋紧密封旋钮，固定转接头；最后，依次用1mol/L的NaCl溶液和去离子水冲洗层析柱10分钟，停泵待用。2.流量标定调节恒流泵以一定转速操作，用一预先称重的锥形瓶收集层析柱出口流出的去离子水，收集过程计时5分钟，收集结束后再次称量锥形瓶重量，通过前后差重与收集时间计算泵的流量。重复测定两次，取平均值，即得恒流泵在该转速下的平均输送流量。通过上述方法，调节泵的转速，使得输出流量QV=2mL/min。3.动态吸附含量及回收率测定【上样样品溶液】浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL的BSA溶液【冲洗液】去离子水【洗脱液】0.1mol/L 、0.3mol/L 、0.5mol/L、0.75mol/L的NaCl溶液【再生液】1mol/L的NaCl溶液【上样时间】5min、10min、15min、20min【操作流量】QV=2mL/min用去离子水平衡层析柱10分钟；上样10分钟，冲洗10分钟，收集上样和冲洗过程的穿透液；用洗脱液洗脱15分钟，收集洗脱过程的穿透液；再生层析柱10分钟。按照上述操作步骤，换不同浓度的上样样品、不同的上样时间、不同解吸液进行测试，通过紫外吸收测