植物组织培养母液的配制与保存.doc

植物组织培养母液的配制与保存植物组织培养母液的配制与保存 一、实验目的 使学生熟练掌握植物组织培养中各种成分或成分组的母液（比需要量大若干倍）的配制方法。二、实验仪器电子天平（感量为0.0001g）、一般天平（感量为0.1g）、烧杯100mL 50 mL 25mL）、量筒（1000 mL 100 mL 50 mL）、容量瓶200 mL 100 mL 50 mL 25 mL）、细口瓶（500 mL 200 mL 100 mL 50 mL）、药勺、玻棒、电炉等。三、实验试剂 按培养基配方准备四、实验原理一）培养基的组成培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。自然状态下生长的绿色植物由于自身能进行光合作用，并且能合成植物生长发育所需的几乎所有有机成分，加上土壤中含有较全面的无机和有机营养成分，所以只需在适当的时候施加少量的无机和有机肥（复合成分），植物就可良好的生长。目前所使用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。例如，White培养基是Uspenski和Uspenskaia（1925）的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养；Cautheret培养基是建立在Knop营养液(1865)基础上的。以后的培养基大部分是在White和Cautheret培养基的基础上改进而成。 就目前所使用的各种培养基而言，可将它们的成分划分为几大类，常用的有MS、 B5 、和White培养基等。1水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。 2无机营养成分：大量元素，主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种微量元素：培养基的微量元素主要包括铁（Fe）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、氯（Cl）、硼（B）和钼（Mo）等。这些元素有的对生命活动的某个过程十分有用，有的对蛋白质或酶的生物活性十分重要，有的是参与某些生物过程的调节。3. 有机营养成分（包括维生素，氨基酸及其它有机物质等）维生素：硫氨素（维生素B1）盐酸吡哆醇（维生素B6）和烟酸 在部分培养基中还添加维生素BX（氨酰苯甲酸）、维生素C（抗坏血酸）、维生素E（生育酚）、维生素H（生物素）、维生素B12（氰钴胺酸）、维生素BC（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱等维生素。氨基酸：甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分。其他：在某些植物或某些组织的培养中还加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。这些可能对某些植物或植物的某些代谢过程有重要作用，如肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。 4. 碳水化合物 所有的植物组织培养基都需要有碳水化合物作为能源，用作碳源的碳水化合物通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，高者可达5%，亦可用市售的白糖所代替，但一般应增加用量，而且最好用比较固定的厂家生产的产品，以保证实验的稳定性。 5. 植物生长调节物质（常称为激素）：生长素类有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸），P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），2，4，5-T（2，4，5-三氯苯氧乙酸）等；细胞分裂素类主要有：从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素6-（4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯氨基）嘌呤。人工合成的细胞分裂素主要有激动素（KT，6-呋喃氨基嘌呤）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、2IP（异戊烯氨基嘌呤）和TDZ（thidiazuron,噻二唑苯基脲）等。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成；赤霉素：主要是GA3，虽然已经用于顶端分生组织的培养和维管分化的研究，但在培养基中很少添加，因为它的作用往往是负面的；乙烯等。6. 琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外，就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。一般浓度0.4%-1%，质量越差的琼脂用量越大。 7. 其他添加剂（含天然提取物、抗生素等） 活性炭 渗透调节剂 抗生素 抗氧化剂等二）培养基的选择选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合与许多单子叶植物，特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效，White培养基适合于根的培养。五、实验内容与步骤一）MS大量元素母液的配制一般将大量元素分别配制成10倍的母液，使用时再分别稀释10倍。依次分别称取： NH4NO3 16.5g KNO3 19.0g KH2PO4 1.70gMgSO47H2O 3.7g CaCl22H2O 4.4g共配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。二）MS微量元素母液的配制一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取：KI 0.083g Na2MoO42H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO45H2O 0.0025gMnSO4H2O 1.69g CoCl26H2O 0.0025gZnSO47H2O 0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。CuSO45H2O和CoCl26H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。分别称取CuSO45H2O 0.05g CoCl26H2O 0.05g各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。三）MS有机质母液的配制 一般配制成100倍MS有机母液。依次称取肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。四）MS铁盐母液的配制一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取：EDTA二钠 3.73g 和FeSO47H2O 2.78g，配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。五）几种生长调节物质的配制 各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精