第八章 重组DNA与现代生物技术.doc

第八章 重组DNA与现代生物技术第一节 农业生产中的应用转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.1.抗虫转基因植物2.抗病转基因植物 3.其他抗逆转基因植物抗除草剂抗冻番茄 4.利用转基因改良植物的品质转基因赖氨酸玉米变色矮牵牛基因工程在农业上的应用：1）高产、稳产和具优良品质的品种 用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。如“转基因高赖氨酸玉米”植株。 2）抗逆性品种 将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高寒等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。 第二节 重组DNA与药品生产美国批准上市的基因工程药品有人类胰岛素、人类生长因子、白介素、干扰素、牛型生长激素疫苗等。我国自1986年“863”计划实施以来，至2000年已有15种基因工程药物，3个基因工程疫苗和数十个重组诊断试剂投放市场。人用蛋白质药物传统生产的弊端： 成本高；产率和产量低；原料易污染，不安全。 基因工程药物可以克服传统方法生产蛋白药物的困难，原因： 可解决蛋白药物的产量问题，只需生长旺盛的表达系统；微生物容易大量培养，能够降低成本；基因工程生产人源的蛋白质药物安全、有效；通过基因工程队编码基因改造以改造蛋白质结构，使之更稳定，活性更高，副作用更低。基因工程药物生产的主要步骤一、分离编码蛋白药物的DNA或cDNA：提取蛋白，纯化，测部分序列，推测编码序列，合成探针，从文库中筛选基因； 用已经纯化的蛋白质制备抗体，然后从表达文库中筛选二、优化基因表达的条件： 表达蛋白的功能； 表达量的多少一、人生长激素的生产 人生长激素（hGH）是脑下垂体前叶分泌的蛋白质类激素，对人体除神经组织以外的所有组织（包括骨骼、肌肉、结缔组织、毛发和皮肤等）都有促进生长的功能。间接地还能促进脂肪和糖类的降解，增强蛋白质和核酸的合成作用。近年来的研究发现，生长激素在治疗侏儒症、烧伤、肥胖、出血性溃疡及在维持肌肉的活力、改善心脏功能、延缓衰老、防治骨质疏松、促进伤口愈合等方面均具有重要的作用。此外，对免疫系统也具有一定的增强作用。 以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。 1979年，人类首次利用基因工程技术在大肠杆菌中表达了人的生长激素，1985年美国FDA首先批准了重组人生长激素上市。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。 应用DNA重组技术，在大肠杆菌中表达人生长激素，有两条不同的技术路线“其一是生产胞内型的重组人生长激素；其二是生产分泌型的重组人生长激素。技术关键是：构建能够在大肠杆菌细胞中表达人生长激素的表达载体二、影响我国生物制药产业发展的因素1.研发投入 国外：23亿美元/基因药物 国内：10多年来，对生物制药的总投入仅有40多亿元 2.投融资与产业化模式 国外：政府、企业、科研院所三位一体，大、中小企业结成战略联盟 国内：政府、企业、科研院所各自为政或偶尔两两结合，投融资机制不健全3.市场竞争环境 国外：市场竞争激烈，但秩序较好，市场份额 多为大公司所垄断 国内：仿制与重复建设、重复生产现象非常严 重，出现了一哄而上的过热现象，市场恶 性竞争，无法实现规模效益4.产品信誉 国外：产品信誉较好 国内：产品信誉低，“出现信洋不信中，买洋不 买中”现象5.创新与知识产权 国外：创新意识高，特别注重知识产权（主要 是专利、商标）保护 国内：创新意识低，严重缺乏自主知识产权产品，当前，我国已产业化的21种基因工程药物和疫苗中只有3种拥有自主知识产权，其他均为仿制产品第三节 蛋白质工程所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。基本内容包括：一、按实际要求，周密审慎地设计新型蛋白质的氨基酸序列结构；二 、通过基因克隆等程序，在适当的寄主细胞中表达比天然蛋白质结构和特性更加优良的新型蛋白质；三、分离纯化符合商业标准的新型蛋白质目前，主要集中在改造现有蛋白质这一领域。一般步骤：（1）分离纯化需改造的目的蛋白（2）对纯化的蛋白进行氨基酸测序、x射线晶体衍射分析、核磁共振分析等。3）通过蛋白结构设计核酸引物或探针，从文库中获取编码该蛋白的基因。（4）设计改造方案并进行改造基因序列。（5）把改造的基因片断插入适当的载体，表达产物。（6）分离纯化产物并进行功能检测。一、定点诱变策略定义：指在DNA水平上改变氨基酸的编码序列。 实施前提： 要改变的基因编码区精确的核苷酸序列 要引入的氨基酸变化1. 用M13DNA进行的寡核苔酸介导诱变这是进行定点诱变最常用的方法，利用了M13噬菌体生活周期中单链形式的存在。由于技术上的原因，采用这种方法通常只有I一5的噬茵斑含有突变的基因。因此，人们又对它做了各种改进。改进的用M13DNA进行的寡核苷酸介导的诱变2. 寡核苷酸介导的PCR诱变此方法不用把基因克隆到M13载体上，也不用为了提高突变率而使用dut-、ung-系统，而且不用将M13上的突变基因再亚克隆到表达载体上。但是需要合成两对引物。3. 改进型双引物诱变把PCR技术应用于M13噬菌体上进行基因诱变。 这种方法较为简便易行，且得到突变体的机率较高，因此是现在较常用的一种获得突变体的方法。4.重叠延伸诱变以线性DNA为模板，进行两次PCR。1.5 简并寡核苷酸引物如果不知道要将原来的氨基酸突变为哪一种新的氨基酸，那么人们通常都采用在一点引入突变，产生所有可能的氨基酸的方法。这种方法有两个优点：不要求知道特定氨基酸的功能；可能有意想不到的收获。1.6 随机诱变随机诱变就是在突变位置上随机地引入一种突变。缺点，即对每一个克隆都需要检测其蛋白的活性，找到所需蛋白后，再对其基因进行测序，只有这时才能确知是哪一个核苷酸发生了突变。寡核苷酸介导的基因突变应注意的各种因素（1）关于单链DNA模板的制备（2）关于寡核苷酸突变因误的设计和选择：a.引物尽可能避免重复序列及形成稳定的二级结构；b.引物突变碱基的两侧有足够长的互补序列；c.选用的寡核苷酸突变引物不能与载体上其他未点形成稳定杂合体；（3）关于突变引物与模板DNA的退火和引物延伸的条件：a.突变引物与模板DNA的比率；b.延伸反应（4）关于DNA聚合酶的选择二、定点诱变在蛋白质工程中的应用人们对酶、对蛋白质进行改造，目的是使它们更适合于工业生产。 提高蛋白质的稳定性是工业生产中很重要的课题。一般来说提高蛋白的稳定性包括以下几个方面： 延长酶的半寿期； 提高酶的热稳定性： 延长药用蛋白的保存期； 抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 1.提高T4溶菌酶的热稳定性理论上，在没有二硫键的蛋白分子中导入二硫键可以提高蛋白热稳定性。在T4溶菌酶中只有两个半胱氨酸（Cys54和Cys97），但这两个半胱氨酸不能形成二硫键，经三维分析发现，第3位的异亮氨酸与第97位的半胱氨酸距离非常近，所以把异亮氨酸突变为半胱氨酸。2.对干扰素（IFN）的改造人的干扰素（IFN）的cDNA在大肠杆菌中表达，产物的抗病毒活性为106U/mg，只有天然糖基化蛋白的10%，而且虽然合成的干扰素量很多，但多数以无活性的二聚体形式存在。人们分析发现，IFN有3个Cys，因此推测可能形成了不正确的二硫键。根据已知结构的类似蛋白IFN，其分子中Cys29和Cys138形成了二硫键，该位置与IFN分子中Cys31和Cys141位置类似，所以推测IFN分子中的另一个Cys17可能带有游离的巯基，于是把它突变为Ser。3.改进1抗胰蛋白酶1抗胰蛋白酶是一种在肝脏中合成后被释放到血液的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其生理功能是保护组织免受弹性蛋白酶的消化作用。弹性蛋白酶是由嗜中性白细胞分泌的一种产物，可对肺造成损害，甚至发展成肺气肿。健康人体中，当1抗胰蛋白酶通过与弹性蛋白酶发生不可逆的结合，便会在其358位的甲硫氨酸和359位的丝氨酸间被切割，同时使后者活性受到抑制，经过这种切割后，复合物便难以解离，从而通过血液排出体外。1抗胰蛋白酶358位的甲硫氨酸非常容易氧化成甲硫氨酸亚砜，氧化后由于分子过大无法嵌到弹性蛋白酶的活性部位，失去了结合能力。应用定点诱变技术把1抗胰蛋白酶的第358位的甲硫氨酸置换成缬氨酸，便可获得抗氧化的1抗胰蛋白酶突变。4.组织型纤溶酶原激活剂的改造组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是人体各种组织均可合成的一种丝氨酸蛋白酶。它能切割纤溶酶原形成纤溶酶，来分解血栓。所以重组的人tPA在临床上用作溶栓剂。天然的tPA半寿期仅有5分钟，在治疗中难以持续地发挥药效。作为一种糖基化蛋白，很容易为肝脏受体所特异识别，于是将其分子中120位的天冬酰胺换成谷氨酰胺，半寿期大大延长。5.对其他的定点改造a. 改变酶的活性b. 对水蛭素的改造c. 对人的生长激素的改造d. 胰岛素的蛋白质工程第四节 抗体工程哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体(antibody)；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原(antigen)。抗体：由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类与相应抗原特异性结合，具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白IgG的基本结构图抗 体 分 子 的 酶 切 片 段一、抗体的结构一个抗体分子(即免疫球蛋白)通常包括两个完全相同的轻链分子(L)和两个完全相同的重链分子(H)，这4条链在氢键和二硫键共同作用下连在一起，形成一个“Y”字型结构。可变区（V区），恒定区（C区）二、抗体的功能Fab片段保存有抗原结合活性和特异性，与Fab片段不同，Fc片段没有抗原结合活性，但它是抗体结合上抗原后激活机体免疫反应的主要部位，它主要激活以下免疫反应：激活补偿功能系统，该系统可分解细胞膜，激活巨噬细胞，并且产生信号以激活免疫反应系统的其他组分。产生抗体依赖性细胞介导毒性（ADCC）。Fab区域结合一个可溶性抗原后，抗体的Fc部分可结合巨噬细胞的Fc受体，使巨噬细胞吞食并毁灭抗原抗体复合体。三、单克隆抗体抗原决定簇：抗原的某些部分，比大分子小得多的有特异性的化学基团，有的仅有6、7个氨基酸组成。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。单克隆抗体：由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。1. 杂交瘤细胞系的产生注意：在制备单克隆抗体时，提供骨髓瘤细胞的动物和进行免疫反应制备B细胞的动物最好来自同一品系。筛选标记:HAT培养基；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）选择系统2.杂交瘤细胞的鉴定收集培养基加到另一个预先包埋好目标抗原的培养板上，清洗，加入二抗，通常在二抗上连有一个酶，可使一种无色底物变成有色物质，如果某个培养孔出现了颜色，就说明该培养基中含有对抗原特异的抗体。三、单克隆抗体的改造及应用人们可以利用杂交瘤技术连续生产纯化的单克隆抗体，抗体现在已被人们视为是一种有效的药物。面临的问题：交叉反应产生免疫反应及过敏反应 。现在的目标是获得高药效低免疫性的人类单克隆抗体。1.单克隆抗体靶向制剂靶向制剂：指借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药、胃肠道或全身血液循环而选择地浓集于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的制剂。制备单克隆抗体靶向制剂的方法主要有三种 a.药物与抗体直接交联 b.药物通过小分子交联剂与抗体连接 c.药物通过大分子载体与抗体相连2.杂交人鼠单克隆抗体鼠源单克隆抗体临床应用中会引起人的抗鼠反应，产生人的抗鼠抗体（HAMA）,于是构建嵌合抗体。嵌合抗体(chimeric antibody)从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。3.人源单克隆抗体a. 分离出产生特殊抗体的人B细胞，用病毒转化使之可以培养生长。b. 把人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，使之产生人源抗体。c. 将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎系中以得到能生产人抗体的转基因鼠4. 抗体酶（Abzyme)概念：抗体酶或催化抗体（Catalytic antibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。抗体酶的制备： a.使用与过渡态结构相类似的半抗原通过杂交瘤技术产生抗体酶。 b.定向催化。 c.对抗体进行化学修饰，使之与催化基团相连。5.单链抗体单链抗体：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。 特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。不易引起人体的免疫排斥，渗透性好。可用来构建双功能分子。单域抗体：仅由单个抗体可变区域构成的功能性抗体。一般只指单个VH功能区域。四、抗体的表达系统1.在重组噬菌体中筛选生产抗体 用杂交瘤细胞生产抗体，杂交瘤细胞在培养基中生长相对较为缓慢，同时培养杂交瘤细胞需要复杂且昂贵的培养基，因此使单克隆抗体技术受到了严重的阻碍。所以人们尝试用重组菌为生物反应器来生产单克隆抗体。 a.组合抗体文库b.随机多肽文库又称人工合成抗原决定簇文库，原理： 人工合成编码随机肽段的基因，克隆到丝状噬菌体中表达多肽于噬菌体表面，构建成一个多肽文库，再通过特异免疫结合反应，从文库中筛选出能模拟某些生物大分子生物功能与活性的短肽小分子。c.目的基因噬菌体抗原决定簇文库与随机多肽文库原理相似，只是在获取编码随机多肽的基因时，不是随机合成，而是通过DNA酶降解一个特定的基因片断形成随机的DNA片断。2.在植物中生产抗体用植物生产抗体有其独特的优越性：一、可用于大规模的大田种植，价格低廉；二、外源基因一般都可以整合进植物的染色体中并稳定遗传；三、转基因植物株系可以通过种子形式长期保存；四、属于真核细胞，对表达的重组蛋白进行正确的加工和修饰。第五节 重组DNA与医学人类的疾病原因内在因素（主要是遗传因素） 外在因素（环境因素） 外在因素+内在因素疾病的分类1. 由环境因素决定的疾病2. 由遗传因素决定的疾病3. 由遗传因素和环境因素共同作用引起的疾病囊性纤维病变:是一种严重隐性基因遗传病. 其特征是频发的呼吸道感染、呼吸困难和最终造成永久性的肺部损伤。糖尿病:糖尿病分1型糖尿病（type 1 diabetes）和2型糖尿病(type 2 diabetes)和妊娠期糖尿病（gestational diabetes）。其中1型糖尿病多发生于青少年，其胰岛素分泌缺乏，必须依赖胰岛素治疗维持生命。2型糖尿病多见于30岁以后中、老年人，其胰岛素的分泌量并不低甚至还偏高，病因主要是机体对胰岛素不敏感（即胰岛素抵抗）。 妊娠期糖尿病（gestational diabetes）是源于细胞的胰岛素抵抗，不过其胰岛素抵抗是由于妊娠期妇女分泌的激素（荷尔蒙）所导致的。妊娠期糖尿病通常在分娩后自愈。AIDS: 艾滋病，即获得性免疫功能丧失综合症，英语缩写AIDS的音译, 是人体注射感染了“人类免疫缺陷病毒”（HIV - human immunodeficiency virus）所导致的传染病。一、疾病的诊断现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法来对病原物质进行诊断检测。有效的诊断方法都应该具备以下3个条件： 专一性强； 灵敏度高 操作简单 1.酶联免疫吸附 a.酶联免疫吸附的原理ELISA通常的检测过程包括以下几个步骤 ： 将待测样品结合在固体支持物上； 加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗，反应后冲洗，洗去未结合上的一抗；加入二抗。二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子。二抗上还联着一种酶，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质。一抗与二抗反应完成后，再次冲洗掉未与一抗结合的二抗； 加入无色底物b 酶联免疫吸附的局限性酶联免疫吸附测定法需要一抗有高的特异性，来提高酶联免疫吸附检测的准确度，才不至于造成假阳性，因此酶联免疫吸附检测只能够作为一种初步的检测手段，要进一步确诊，还必须进行western检测。2.DNA诊断（gene diagnosis） 人类疾病的发生，除人体内的内源基因的突变外，还涉及到外源性基因的入侵，各种微生物、病毒和寄生虫感染机体，都会造成特异的外源基因引发疾病，所以，通过基因分析，找出内源基因的异常和发现外源基因，从而快速、敏感地诊断有关疾病，这就是基因诊断的目的。利用基因探针、PCR等技术直接探查基因的存在和缺陷，对人体状态和疾病作出诊断，称为基因诊断或DNA诊断。基因诊断的目的物主要是DNA，其次也包括基因的转录产物mRNA。基 因 诊 断 的 特 点针对性强 以探测基因为目标，属于“病因诊断” 特异性高 以分子杂交技术为基本原理 灵敏度高 基因探针带有十分敏感的检测标记，待测标本微量 适应性强 基因探针可为任何来源，任何种类；探针序列可为已知亦可未知，检测目 标可为特定的基因或基因组合，可为内源基因亦可外源基因，诊断范围广a. 核 酸 杂 交核酸杂交是DNA诊断分析方法的一种，其工作原理是两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成氢键。通常核酸杂交的检测过程主要包括以下几个步骤： 将单链目的DNA结合于膜上； 加入单链、标记过的探针DNA ，在一定的温度条件和离子浓度下使探针分子与目标DNA分子碱基配对； 冲洗，洗去多余的未结合的标记探针DNA； 检测探针和目标DNA形成的杂合分子； 杂 交 探 针 用作杂交的探针应该是高度特异性的DNA或RNA片段，也就是说，探针DNA或RNA必须只与持定的目标DNA序列杂交。杂交探针的分离:提取病原微生物染色体的DNA；酶解；克隆进质粒载体，构建质粒文库；与病原微生物和非病原微生物的核DNA进行杂交；对有杂交信号的重组质粒的插入片段作进一步确定，并筛选。 非同位素标记杂交探针原理：通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学发光物质而达到放大信号的目的。非放射性检测系统的优点：寿命长，利于保存；灵敏度高；操作简便，用时短；安全性好。用生物素标记的杂交探针进行杂交的过程： 将生物素标记的探针与目标DNA杂交； 加入抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白； 加入一种经生物素标记的酶； 加入生色或化学发光的底物，然后根据颜色变化或化学发光来检测杂交的结果。b. 疟疾的分子诊断传统的检验方法：对抽取的血样进行显微镜检查。酶联免疫反应检测：无法区别感染过疟原虫的患者和正在感染者。DNA杂交诊断：检测的是带有DNA的疟原虫，而不是疟原虫的蛋白或其抗体。前提是：分离杂交的探针。3.遗传疾病的分子诊断技术对于遗传疾病上DNA诊断分析主要是针对产前诊断以及症状发生前的早期诊断，以防止出生缺陷来提高人口质量。a. PCR酶解鉴定此法应用的条件： 突变位点恰好位于一个限制性内切酶位点b. PCR/OLA鉴定它是把PCR同寡聚核苷酸连接分析(oligo-nucleotide ligation assay,OLA)结合起来的一种检测方法。本质：分辨两个寡聚核苷酸探针是否实现了连接确定X和Y两条探针是否实现了连接： 在探针X的5端标记上生物素，在探针Y的3端标记上地高辛； 杂交和连接后，变性DNA,释放探针，转至链霉抗生物素蛋白的小孔中，冲洗； 加入连接有碱性磷酸酶的抗DIG的抗体，冲洗； 加入无色生色底物c. 连接酶链式反应（LCR）鉴定注意：两个引物量要大大过量；杂交系统中要加入一种耐热的DNA连接酶。d. PCR-ELISA检测在PCR扩增以后，在酶标板上借用酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。被称为PCRELISA。 e. 同一基因中多个不同位点的突变的检测多数情况下，基因内的许多不同的位点都有可能发生突变，而每个突变可能导致同一种遗传疾病。这样只检查一处核苷酸的突变是不够的，但是对各突变点依次检查太繁琐，费用也太高。特异性等位基因寡核苷酸杂交（ASO）原理：对待测样品进行PCR扩增反应之后，扩增产物分别与生物素标记的野生型寡核苷酸探针和突变型寡核苷酸探针在严格条件下进行杂交，根据杂交带的强弱来判断是否有突变发生。 扩增阻滞突变系统（ARMS）人工引入酶切位点（AIRS）又名限制性内切酶位点引入PCR。原理：在突变位点引入一错配碱基，从而引入一个新的酶切位点，以便对突变体的检测。直接测序法（DS） DS法是将测序技术与PCR技术相结合而形成的一种检测方法，利用这种方法，PCR产物无需经过克隆就可进行测序。一般是通过不对称PCR法获得用于测序的单链与固定在尼龙膜上的寡核苷酸序列杂交，根据杂交信号推测待测序列。引物延伸法（PEX）原理：利用引物延伸到突变位点的前一个碱基，然后将延伸产物分成两管，分别与待测样品的基因组DNA退火，然后在两管中分别加入不同标记的碱基，继续进行延伸反应。根据标记物的性质，检测哪一种碱基掺入到了新的延伸产物中，即可判断待测样品是否有突变。 多聚酶链式反应-单链构想多态分析PCR-SSCP是利用不同构象的单链DNA的迁移率不同而设计的。4. 癌症的分子诊断技术美国前副总统汉弗莱Humphrey) 在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切 片未发现癌细胞-良性“慢性增生性囊 肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查，发现那时的组织细胞虽然在形态上还没有表现出恶性变化，但其P53基因的第227个密码子已经发生了一个核苷酸的突变。就是这个基因的微小变化，使其抑癌功能受损，导致九年后细胞癌变的发生。这说明，在典型症状出现之前的很长时间，细胞癌变的信息已经在基因上表现出来了现代生命科学飞速发展，已经发现了一些较为成熟的治疗癌症的方法。但是，治疗癌症的关键是，在肿瘤尚未形成或还很小的时候就能检测出异常基因的存在，在未出现任何症状之前即检测出肿瘤的发生，这样能够比任何新型药物疗法挽救更多的生命。 此外，在癌症发生时，端粒酶会具有活性，它可以阻止端粒变短，防止细胞衰老和死亡，所以肿瘤细胞是不易死亡的。因此，人们可以通过对端粒酶的检测来作为对癌症的早期诊断标准。5. 环境微生物的检测微生物的存在离不开环境，而微生物的数量分布和种群组成、理化性状、遗传变异等，又是环境状况的综合而客观的反映。利用微生物监测环境污染，可了解不同污染状况及其近期、远期影响。新理论、新技术的渗透和应用，使监测方法不断完善、革新，更为灵敏、快速、准确。在环境微生物检测中常用的方法是菌落原位杂交和从样品中提取核酸进行杂交二、 生物技术与疫苗注射或口服疫苗可以激活免疫系统，使接受者诱导产生致病物质的抗体。以至于以后遇见同样的致病物侵入，免疫系统仍会被激活。典型的疫苗主要是灭活的和减毒的致病物质，前提是：不能丧失引起免疫反应的能力。疫 苗 的 发 展 历 史第一代疫苗：利用减毒或弱化的病原体。第二代疫苗：基因工程疫苗（将病原体的抗原基因克隆在细菌或真核细胞内，利用细菌或细胞生产病原体的抗原）。第三代疫苗：核酸疫苗（将含有编码目的蛋白质基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答）。1. 基因工程疫苗a.亚基疫苗概念：利用病源物的某一部分制得的疫苗。优点：避免了直接使用病源物而使接受者可能致病的危险；避免由于外源蛋白、核酸的混杂而造成的种种副作用；增强免疫。局限：纯化单一蛋白十分昂贵；纯化后的蛋白构象与在体内时可能不同；激活的免疫反应一般较弱。b. 肽 疫 苗把类似于抗原决定簇的小肽当作疫苗。利用小肽作疫苗的局限： 充当抗原决定族的肽段不能太长，而且要连续； 要求肽段的构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致； 要求选定的单一的抗原决定簇必须要有足够强的免疫原性。2. DNA 免 疫核酸疫苗(nucleic acid vaccines)是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。 DNA免疫的优越性：DNA比蛋白质更稳定，在制成干粉后可以保存的时间较长；DNA的提取纯化比蛋白质的提取纯化要容易很多；免疫应答持久，由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，它可以持续地给免疫系统提供刺激 ；任何DNA片段都可以插入质粒中制成疫苗，而且在同一个质粒上可以同时容纳一个以上的抗原基因；核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能。基因免疫只对表达的抗原而不对载体产生免疫应答，故同一质粒可以用于转运不同的靶基因而多次使用，也可在一个载体上构建表达多种抗原的被称为复合疫苗或多价疫苗的多功能疫苗，达到一次免疫能取得多次不同免疫相同的免疫效果。 DNA疫苗对于一些目前难以用常规疫苗防治的疾病的预防和治疗有重要意义。DNA免疫的弊端普遍存在免疫效力较低的问题插入生殖细胞基因组可能引起下一代遗传病 机体长期表达外源性抗原可能产生另一些不良的后果：产生抗DNA抗体、自身免疫、过敏反应、超免疫力或自身攻击。 3. 艾滋病疫苗获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)-艾滋病,是由人免疫缺陷病毒(HIV)所引起的体液传播疾病。a.HIV病毒简介HIV是一双股单链RNA病毒，属逆转录病毒科，慢病毒亚科。分为两型，即HIV1和HIV2。目前世界范围内流行的主要由HIV1所致。HIV2仅在西非部分地区流行。 HIV对热敏感，5630分钟、25%以上乙醇、0.2%次氯酸钠、1%戊二醛等处理后均可灭活。但对0.1%福尔马林、电离辐射和紫外线等的抵抗力较强。人免疫缺陷病毒 HIV 结构图HIV病毒的生活史b. HIV病毒的致病机理HIV在繁殖过程中可以通过以下方式杀伤CD4，从而导致免疫功能受损： 感染的直接毒性作用 细胞融合 3干细胞受HIV感染 4自身免疫的破坏c. HIV疫苗 HIV蛋白亚单位疫苗 HIV亚单位疫苗是发展最早也是世界上唯一进入临床阶段的艾滋病疫苗，其主要原理是利用酵母、秆状病毒-昆虫细胞等表达系统高效表达并纯化HIV病毒抗原蛋白，免疫人体后产生针对HIV病毒的免疫反应。 HIV活载体疫苗 此类疫苗是将以往作为人类疫苗应用过多年的减毒病原体，如牛痘苗、禽痘病毒等进行改造后作为载体，将HIV的重要抗原基因插入其内，导入人体进行表达。 活载体疫苗由于可在体内复制而具有良好的免疫原性，活载体本身还可作为免疫佐剂，因而此类疫苗广受国内外研究者的重视。 HIV DNA 疫 苗 核酸疫苗是近年来兴起的一类新型疫苗。它得益于成熟的基因工程技术以及多样的载体系统和转移技术, 发展十分迅速,已跻身于HIV疫苗领域三、基因治疗基因治疗是指目的基因导入靶细胞以后与宿主细胞内的基因发生重组，成为宿主细胞的一部分，从而可以稳定地遗传下去并达到对疾病进行治疗的目的。现代：目的基因和宿主细胞内的基因不发生重组，目的基因也能得到暂时的表达。目前人类基因治疗主要集中在遗传性疾病、肿瘤及某些传染性疾病。至1997年初，全世界共记录了2103例基因治疗病例（美国1700例）。其中68%是治疗肿瘤的，19%是治疗遗传病的，12%治疗传染性疾病等。第一例基因治疗的疾病是1990年9月FDA批准的用ada（腺苷脱氨酶）基因治疗SCID（严重型联合型免疫缺陷症。第一例接受治疗的是一位4岁的女孩，第二例是一位9岁的女孩。美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，过上了正常人的生活。转基因治疗血友病 导入凝血因子基因的转基因绵羊，其分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子，能有效地用于血友病的治疗1994年，中国用导入人凝血因子基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者1. 基因治疗的策略基因置换：用正常的基因整个地替代突变基因，使突变基因得到永久的更正；基因修正：将突变基因的突变碱基序列用正常的序列加以纠正，而其余未突变的正常部分予以保留；基因修饰：将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可以补偿致病基因的功能，致病基因本身并未得到改变。基因失活：利用反义技术来封闭某些基因的表达，以达到抑制有害基因表达的目的。因抑制：导入外源基因去干扰、抑制有害基因的表达 2. 基因治疗的原则 必须分离出具有特定功能的特异性基因；必须能够获得足够数量的携带有该基因的载体和细胞；必须建立一条有效的途径将该外源基因导入体内、转染靶细胞；转染并进入宿主细胞的目的基因必须能产生足够量的产物，可以维持适当长的时间，且不产生有害的副作用。a. 选择目的基因的原则：待研究基因的异常是疾病发生的根源；该基因遗传的分子机制已经研究清楚；基因已经被克隆，且表达调控机制较为清楚；转移的基因 在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合到宿主细胞的染色体中，并能适时适量表达功能性蛋白质。基因治疗中选择的目的基因可以来自染色体的基因组，也可以来自来源于mRNA的互补DNA（cDNA），而且以后者居多。另外，目的基因必须置于合适的启动子控制之下，且必须含有完整的信号肽，只有这样，目的基因才可能获得适当的表达。b. 选择受体细胞的原则最好选择组织特异性细胞；细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生命周期较长；离体的细胞应能接受外源基因转染；细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能安全输送回体内。3. 遗传性疾病的基因治疗遗传病是指由人体内的遗传物质发生改变所引起的疾病。根据遗传物质的变异情况，遗传病可以分为三类：（1）单基因遗传病：指由单个基因发生突变所引起的疾病。（2）多基因遗传病：指由多个基因与环境因子共同作用所引起的遗传性疾病。（3）染色体异常病：遗传物质的突变涉及到染色体上的很大一部分，如染色体部分断裂后出现的染色体易位、缺失、倒位和重复等染色体畸变，均导致遗传物质偏离正常状态，引起疾病。常见遗传病的基因治疗 血红蛋白病血红蛋白由珠蛋白和血红素辅基组成。每个血红蛋白分子是由个亚单位构成的四聚体，每个亚单位由一条珠蛋白肽链和个血红素辅基构成。研究证实，在血红蛋白病中，镰刀型贫血和地中海贫血都是由于成人珠蛋白活性水平很低所致，而珠蛋白的活性降低又与机体中链基因完全关闭有关，因此如果采用让链基因持续开放或者使已经关闭的链基因重新激活，就有可能解决珠蛋白表达比例失调的问题，进而在基因水平上治疗上述两种贫血病。 血友病血友病是一种常见的遗传性出血性疾病，它是由于血液中缺乏某种凝血因子而导致患者的凝血功能出现障碍。基因治疗是将正常基因转入患者体内替代缺陷基因，从基因水平上纠正基因的缺陷，从而达到治疗的目的，为血友病的治疗开辟了一条新途径。 家族性高胆固醇血症 家族性高胆固醇血症是由于低密度脂蛋白受体缺陷而导致血中胆固醇水平过高，患者多死于冠心病。是一种多基因遗传病。通过基因治疗可以表达更多的低密度脂蛋白受体，以便降低血液中胆固醇的水平。4.肿瘤的基因治疗肿瘤基因治疗（gene therapy of cancer）是指以适当的基因转移技术将特定的外源基因导入肿瘤细胞或患者体细胞内，通过外源基因的表达产物或对宿主细胞本身基因表达的影响，直接或间接地杀伤或抑制肿瘤细胞，或为其它肿瘤治疗方法创造有利条件的一种肿瘤生物治疗方法。 尽管基因治疗的研究和应用起源于对遗传病的治疗，但近年来肿瘤基因治疗的发展却远远超过了遗传病的基因治疗，这主要是由于（1）恶性肿瘤的发病率远远高于遗传病的发病；（2）外源目的基因选择的余地增大；（3）肿瘤的基因治疗不需要象遗传病那样终生持续应用，而只需要较短的疗程即可；（4）肿瘤的基因治疗不需要外源基因持续表达，阶段性表达甚至过量表达也可以达到杀伤肿瘤细胞的目的；（5）对目的基因表达调控的要求远不如遗传病治疗时严格。目前有关肿瘤基因治疗的研究主要集中在以下几个方面： a. 细胞因子导入疗法细胞因子是免疫活性细胞分泌的多肽类物质，它们调节多种细胞的生理功能和免疫应答。将编码细胞因子的基因导入细胞，使其在宿主或局部肿瘤中稳定、持续的表达，通过增强肿瘤微环境中抗癌免疫达到治疗肿瘤的目的。b. 肿瘤抑制基因疗法 在肿瘤的发生和演变的过程中，涉及多个肿瘤的抑制基因和癌基因的改变。其中，肿瘤抑制基因的失活与肿瘤的发生密切相关。将正常的肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞可以替代或补偿有缺陷的基因，从而达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的目的c. “自杀”基因疗法自杀基因所编码的蛋白产物能够使无毒性的化疗药物的前体在细胞内转换为强毒性药物，导致肿瘤细胞“自杀”而死亡，达到选择性地杀伤肿瘤的目的。正常组织由于未转染该基因，不能表达该“自杀