脲和盐酸胍在包涵体蛋白质提纯中的作用.doc

脲和盐酸胍在包涵体蛋白质提纯中的作用脲和盐酸胍变性剂如脲和盐酸胍等可使蛋白质结构中的氢键发生断裂，这增加了非极性分子包括氨基酸侧链的溶解度，减少了疏水相互作用；脲还可以深入到蛋白质分子的内部影响蛋白质分子的密堆积。此外，去污剂、有机溶剂、重金属、热、机械力、冷冻、超声、高压、辐射等均可引起蛋白质的变性。这些变性均不会破坏蛋白质的共价键而是只涉及到氢键、盐键、疏水相互作用、范得华相互作用等次级键的破坏。有些变性的蛋白质当变性因素被除去后又可自动地恢复到天然状态，这种现象称为蛋白质的复性(renaturation)，这种复性即蛋白质折叠研究中的重折叠(refolding)。（1931年吴宪提出的蛋白质变性学说）包涵体蛋白质提纯大多数在pH8的条件下，一般用强的变性剂如尿素（6-8mol/L）、盐酸胍（GdnHCl 58mol/L或6mol/L），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还有有机溶剂、碱性环境（大于9）或酸（70%甲酸）也可使之溶解。在变性液中需加入还原剂，如2巯基乙醇(-ME)、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽（GST）、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM -ME或DTT，也有文献使用5mM浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。同时还需加入金属鳌合剂如EDTA或EGTA，以鳌合Cu2+、Fe2+等金属离子，防止已经处于还原状态的巯基与之发生氧化反应。变性剂溶解后，蛋白质失去了生物学活性。蛋白质的变性(denaturation) 定义： 蛋白质在某些理化因素作用下，特定的空间结构被破坏而导致其原有的理化性质改变及生物学活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性作用。变性后的蛋白质称为变性蛋白质。能引起蛋白质变性的化学试剂称为变性剂。 使蛋白质变性的理化因素 物理因素：加热、紫外线、X线、超声波、 剧烈振荡等 化学因素：强酸、强碱、生物碱试剂、 重金属盐、高浓度尿素、盐酸胍、有机溶剂等。 蛋白质变性的本质 最早对蛋白质变性本质作出解释的是我国生化学家吴宪教授，他早在1931年就指出：蛋白质变性就是它的肽链从卷曲至伸展的过程。以后几十年的研究都证明了该学说。变性因素只破坏了主要的次级键