自主设计性实验补充说明.doc

自主设计性实验补充说明1. 设计要求具有科学性、实用性、创造性和安全性，具有较强的实际意义，以创新及紧密联系生产为佳。并不要求所有作品为100%原创，但不能照搬现有文献与资料，可在现有资料的基础上进行创新与改进。2. 实验可操作性强，实验试剂中严禁使用剧毒、危险药品，严禁使用易爆装置。3. 初审反馈后，再做PPT，在答辩的时候交。以设计书的格式制作PPT，不要全抄，内容简明扼要，可参考实验课件。4. 设计书要按照讲义的要求格式撰写，后面附有4份实验设计书供参考。5. 可使用仪器表序号 仪器名称 型号、规格 厂家/产地 1 分光光度计 V-1100 上海美谱达/上海 2 分光光度计 UV-1100 上海美谱达/上海 3 分光光度计 Biophotometer Eppendorf/德国 4 电泳仪 DYY-6C 北京六一/北京 5 转移用电永仪 DYY-7C 北京六一/北京 6 卧式水平电泳槽 DYCP-38B 北京六一/北京 7 水平电泳槽 DYCP-31CN 北京六一/北京 8 垂直电泳槽 DYCZ-24DN 北京六一/北京 9 电转移槽 DYCZ-40D 北京六一/北京 10 脱色摇床（钟摆式） WD-9405A 北京六一/北京 11 脱色摇床（水平式） WD-9405B 北京六一/北京 12 凝胶图像分析仪 Tanon-1600 上海天能/上海 13 紫外透射检测仪 WD-9403A 北京六一/北京 14 PCR仪 Bio-rad MJMini 15 台式高速离心机 5415D Eppendorf/德国 16 低速台式离心机 TDL-40B 上海安亭/上海 17 低温台式高速离心机 TGL-16G-A 上海安亭/上海 18 低温高速离心机 GL-20G- 上海安亭/上海 19 低速冷冻大容量离心机 DL-5000B 上海安亭/上海 20 分析天平 ALC-210.4 赛多利斯/中国 21 电子天平 ALC-2100.2 赛多利斯/中国 22 pH计 PB-10 赛多利斯/中国 23 纯水机 KL-RO-20 艾柯/成都 24 超纯水器 KLZ-VP 艾柯/成都 25 高压灭菌锅 MLS-3750 SANYO 26 制冰机 XB-70 格兰特/宁波 27 电热恒温鼓风干燥箱 SFG-02.500 黄石恒丰/湖北黄石 28 超净工作台 SW-CJ-2F 苏州安泰/苏州 29 恒温摇床 THZ-D 江苏太仓/江苏 30 电热恒温培养箱 SKP-02B-420 黄石恒丰/湖北黄石 31 三孔电热恒温水槽 DK-8D 上海一恒/上海 32 电热恒温水槽 CU-600 上海一恒/上海 33 普通冰箱 34 25冰箱（卧式） DW-25W388 35 86冰箱（卧式） DW-86L386 40 其他普通化学实验常用仪器。4份实验设计书样本豆奶粉营养成分重要指标测定食品学院 04级食品科学与工程专业2班 陈玄民 黄珊 蔡淑娇 前言：豆奶是我国传统的日常饮品，专家指出，豆奶的营养丰富，含有优质的大豆蛋白和脂肪，也含有维生素B1、B2等。其中所含有的微量元素和卵磷脂、异黄酮等成分对人体具有防癌、防止骨质疏松等保健作用，是一种较好的营养食品。但是，豆奶的保质期较短，这严重影响了其生产及销售，于是，豆奶粉应运而生。在短短的时间内，货架上的豆奶粉品牌越来越多，国家对于豆奶粉的生产也制定了相应标准中华人民共和国行业标准 速溶豆奶粉 QB/T207595。在产品质量抽查中，豆奶粉也出现有不合格的现象，如蛋白质含量不符合国家标准，脂肪含量偏低，水分偏高，大肠杆菌超标等问题。所以，我们将采用国家标准规定的检测方法，检测某种品牌豆奶粉的几项重要指标（蛋白质、脂肪、水分）的含量，看其是否达到国家标准。 摘要:按照国家规定的测定方法，测定某种品牌豆奶粉中蛋白质、脂肪、水分的含量。参照国家豆奶粉行业生产标准，评价其是否符合国家规定的各项指标。 关键词:豆奶粉 蛋白质 脂肪 水分 1 实验材料：某品牌纯豆奶粉。1.2实验主要仪器：凯氏定氮消化装置和定氮蒸馏装置(自带)、电子天平、通风橱、电炉（2个）、100ml具塞刻度量筒、铝皿(2个)、鼓风电热恒温干燥箱、干燥器。1.3实验方法：凯氏定氮法测定蛋白质含量；酸水解法测定脂肪含量；常压加热干燥法测定水分含量。 2蛋白质测定2.1实验目的测定豆奶粉中蛋白质含量。2.2实验原理以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收，再用盐酸标准滴定溶液滴定。根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。2.3实验装置 锥形瓶（3个）、酸式滴定管（1支）、玻璃棒（1支）、100mL量筒（2支）、10mL移液管（1支）2.4实验试剂固体硫酸铜、固体硫酸钾、浓硫酸 、95%乙醇；40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；4%硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至100mL；0.1mol/L盐酸标准滴定溶液；甲基红-次甲基蓝混合指示液：甲基蓝乙醇溶液:甲基红乙醇溶液=1:2（体积比）。2.5实验步骤称样、处理消化蒸馏滴定称样、处理: 称取0.52g试样，精确至0.001g，放入凯氏烧瓶中（避免粘附在瓶壁上）。 消化:向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫酸钾10g、浓硫酸20mL及数粒玻璃珠。将凯氏烧瓶置于消化装置中消化至溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.51h。取下凯氏烧瓶冷却至约40，缓慢加入适量水，摇匀。冷却至室温。 蒸馏:将上述溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。向接收瓶内加入10mL4%硼酸溶液和23滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取10mL稀释定容后的试液，移入反应室。塞紧玻璃塞。量取10mL40%氢氧化钠溶液注入反应室，立即塞紧玻璃塞。蒸馏3040min。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏1min。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。滴定:用0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。同一试样做两次平行试验，同时做空白试验。 2.6分析结果 式中：x食品中蛋白质含量（质量百分率），（m/m）或%(m/V)；滴定试样时消耗0.1mol/L盐酸标准滴定溶液的体积，mL;V0空白试验时消耗0.1mol/L盐酸标准滴定溶液的体积，mL;C盐酸标准滴定溶液的摩尔浓度，mol/L；0.0141mL1mol/L盐酸标准滴定溶液相当于氮的质量，g；m试样的质量，g； 3脂肪测定3.1实验目的测定豆奶中的脂肪含量。3.2实验原理试样经酸水解后用乙醚提取，除去溶剂即得总脂肪含量.酸水解法测得的为游离及结合脂肪的总量。3.3实验试剂盐酸、乙醇(95%)、乙醚、石油醚(3060沸程)。3. 4实验装置 50ml大试管、锥型瓶（1个）、10ml量筒（1支）、10ml移液管（2支）、玻璃棒（1支）、大烧杯（1个）、3.5实验步骤称样、处理水浴萃取烘干 称样、处理：称取约2.00g试样置于50ml大试管内，加8ml水，混匀后再加10ml盐酸。水浴：将试管放入70-80水浴中，每隔5min10min，以玻璃棒搅拌一次，至试样消化完全为止，约40min-50min。萃取：取出试管，加入10ml乙醇，混合.冷却后将混合物移入100ml具塞量筒中，以25ml乙醚分次洗试管，一并倒入量筒中.待乙醚全部倒入量筒后，加塞振摇1min，小心开塞，放出气体，再塞好，静置12min，小心开塞，并用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪.静置10min-20min，待上部液体清晰，吸出上清液于已恒量的锥型瓶内，再加5ml乙醚于具塞量筒内，振摇，静置后，仍将上层乙醚吸出，放入原锥型瓶中。烘干：将锥型瓶置于水浴上蒸干，置100烘箱中干燥2h，取出放干燥器内冷却0.5h后称量，重复以上操作直至恒量。3.4分析结果 式中：x试样中粗脂肪的含量，单位为克每百克（g100g）; m1接收瓶和粗脂肪的质量，单位为克（g）； m0接收瓶的质量，单位为克（g）； m2试样的质量，单位为克（g）； 4水分测定4.1实验目的测定豆奶中的水分含量。4.2实验原理试样在常压1032的恒温干燥箱内加热至恒重。加热前后的质量差即为水分含量。 4.3实验步骤铝皿的烘烤称样、加热干燥冷却称量 铝皿的烘烤：将洁净的铝皿连同皿盖置于1032的鼓风电热恒温干燥箱内，加热1h，加盖取出，置于干燥器内冷却至室温，称量（精确至0.001g）。称样、干燥、称重：称取约5g试样，精确至0.001g，于已知恒重的铝皿中，置于1032的鼓风电热恒温干燥箱内，加热24h，加盖取出。在干燥器内冷却0.5h，称量。再置于1032的鼓风电热恒温干燥箱内，加热1h，加盖取出，冷却0.5h，称量。重复操作直至连续两次称量差不超过0.002g，即为恒重。以最小称量为准。 4.4分析结果式中：食品中水分含量（质量百分比），；m1试样和铝皿烘烤前的质量，g;m2试样中铝皿烘烤后的质量，g;m试样的质量，g.附表 豆奶粉理化指标规定 参考文献：中华人民共和国行业标准 中华人民共和国行业标准 速溶豆奶粉 QB/T207595；中华人民共和国国家标准 食品中蛋白质的测定方法 GB/T14771-1993；中华人民共和国国家标准 食品中的脂肪的测定 GB/T5009.62003；中华人民共和国国家标准 食品中水分的测定方法 GB/T147691993黄晓珏 刘邻渭.食品化学综合实验.中国农业大学出版社 经费预算：某品牌纯豆奶粉1包（600克） 20元内红火蚁毒素杀菌作用机理的生化检测 中山大学生科院03生物科学专业林圣中山大学生科院03生技应用专业谢吉佶中山大学生科院03生技应用专业李梦真 1实验目的1.1用次抑菌浓度获取受抑态菌株并测定其抑菌率1.2细胞电泳法测定受试菌表面电荷的变化1.3利用TBA法测定受试菌脂质过氧化程度1.4比较受抑态菌与正常菌蛋白表达的差异1.5生物信息学手段分析差异表达蛋白1.6分析讨论以上各项与红火蚁毒素抑菌作用的关系2实验原理2.1 入侵红火蚁（Solenopsis invicta）是隶属于膜翅目、蚁科、火蚁属的一种社会性昆虫,和我们常见的蚂蚁是近亲，原产于南美洲的巴西和阿根廷。入侵红火蚁生态习性属于向阳物种，喜欢筑巢于有日照之开放空间，且蚁丘几乎可在任何土质上筑巢，常出现的环境包括草坪、公园、牧草地及田地等，对农业，通信，景观等造成巨大的破坏。更为重要的是，入侵红火蚁有很强的进攻性，只要略微受到干扰，就会迅速地对人畜发动攻击。攻击物体时以大颚咬紧皮肤,利用其螫针连续针刺7至8次并形成一个环形的刺痕,或者离开继续向前叮咬形成一串刺。其毒囊中的毒液伴随着每1次针刺注入被刺的皮肤。毒液含有高浓度的毒素,导致剧烈的灼烧般的疼痛。其毒素可引起全身性搔痒,荨麻疹,脸部燥红肿涨,呼吸困难,胸痛,心跳加快等症状,引发过敏性休克,严重者甚至导致死亡。红火蚁毒素的主要成分为生物碱哌啶，另有少量的毒蛋白。除了具有上述的各种危害性外，研究还发现红火蚁毒素具有一定的杀菌、抑菌作用。但是其抑菌作用的机理尚未有深入的研究。因此，本实验拟通过检测最常见的几种抑菌方式，对红火蚁毒素的抑菌作用机理做初步的探索。2.2 在次抑菌浓度（略低于致死浓度）的红火蚁毒素作用下，受试菌生理活动受到一定程度的抑制，又不至于死亡，处于一种受抑态。在这种环境胁迫状态下，受试菌会产生一系列的生理生化变化。例如，一些应激反应的蛋白启动表达而另一些暂不需要或受抑的蛋白则关闭或减弱表达；细胞膜成分发生改变导致其膜电荷发生相应的变化；细胞内脂质发生过氧化反应等。因此，通过检测其蛋白表达谱的差异、细胞所带电荷的变化以及胞内丙二醛（MDA）的水平，就可以初步推断出红火蚁毒素的部分抑菌作用机理。当然，可能的抑菌作用途径还有很多，我们这里仅是检查了很少的一部分（但却是最为普遍的抑菌机制），所以，红火蚁毒素的抑菌作用机理很值得进一步深入研究下去。-基金项目：广东省自然科学基金（4203203）、农业部攻关项目、中山大学生化系科研基金资助作者简介：林圣，男，1984年生，03级本科生，研究方向为入侵生物防治及其基础研究，E-mail：2.3 在电场作用下,液体介质中的悬浮质点与介质间的相对运动,称为电泳。将细胞制成悬浮溶液,使其单个游离的细胞分散于等渗的介质中,在电场作用下,细胞在电泳室内发生运动。这种现象称为细胞电泳。 每种细胞在恒定的条件下(如温度、电压、电流、介质浓度、pH值等)其电泳速度和电位十分稳定,但在各种有害因子、病理状态的影响下,会改变其表面电荷,所以细胞电泳速度和电位值也发生改变。在医学和生物学领域中，应用细胞电泳技术研究生命结构的表面性质，推测其构造和功能、大分子物质在细胞表面的吸附、进行免疫反应，以及鉴定细胞或单细胞有机体的机能和病理状态具有重要的意义,这是一种十分有用的检测方法。本实验中，用细胞电泳的方法检测在sub-MIC的红火蚁毒素作用下受试菌体表面电荷的变化。 2.4 细胞膜脂质过氧化反应的终末产物MDA与硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下生成有红色荧光的化合物，红色物质是由一1分子MDA与2分子TBA缩合失去2分子水形成的，反应的方程式如下所示。该化合物的可见与紫外最大吸收波长处于512535nm，次吸收波长位于245305nm，红色的深浅是样品中MDA的量度。 2.5 SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的（约18），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2.6 通过SDS-PAGE或者2DE（IEF/SDS-PAGE）获取的受试菌与正常菌的蛋白表达差异图谱，辅以分子量、等电点、飞行质谱等一些信息，利用计算机软件PDQuest6.2.1进行分析并检索蛋白质数据库PIR与SWISS-PROT，可了解这些差异蛋白所属蛋白家族、可能参与的作用并依此进一步推断红火蚁毒素的抑菌作用机理。这项操作较为复杂，需要有较为深入的计算机知识。因此，我们欲待实验结束后与他人合作共同完成这一计算机分析。3实验操作步骤3.1 实验材料制备3.1.1 野外采集一窝高活性的红火蚁(采集地为珠海)，密封袋封存后即刻用冰冻方法处死。将其置于冰盒中带回实验室后4冰箱保存。3.1.2 实验前，将保存的红火蚁取出，称取2份每份各10g，一份加30ml双蒸水，另一份加30mlPBS(PH7.0，0.1mol/L)，冰浴下研磨（一是为了防止还有活蚁幸存，二是减少蛋白酶可能对红火蚁毒素中少量蛋白成分的破坏作用），获取红火蚁的全蚁浸出液（Whole Body Extract,WBE）。由于纯的红火蚁毒素极难得到，因此国外研究红火蚁毒素普遍采用全蚁浸出液，除少量分析其成分的实验才采用较纯的毒素，因此本实验亦采用全蚁浸出液作为毒素的替代品。3.2 受抑态菌株的制备3.2.1 采用倍比稀释浓度梯度法测定红火蚁毒素（WBE）对受试菌苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis，BT）的最低抑制浓度（MIC）。3.2.2 在LB培养液中接种BT，35、150r/min摇床振荡培养24h后，分装入三组12根试管,每管2.5ml菌液。1-4号管为第一组，每毫升菌液加入1ml生理盐水作为对照，5-8号管为第二组，每毫升菌液加入1ml用双蒸水制备的WBE，9-12号管为第三组，每毫升菌液加入1ml用PBS制备的WBE，形成次抑菌浓度（sub-MIC，略低于最低抑制浓度）。同样在35、150r/min摇床振荡培养12h后取出，此时获得的菌液即为处于受抑态的BT菌。3.2.3 每组取两根试管的菌液再通过4下8190r/min离心10min，收集菌体；再用生理盐水洗涤菌体3次，8190r/min, 4离心10min，收集菌体。3.3 分光光度法测定WBE的抑菌率 每组取剩余两根试管的菌液，测定600nm波长下培养液的光密度值（OD），即可估算出菌液的浓度（见图1），并可由此计算出WBE的抑菌率。图1细菌培养液浓度的确定3.4 细胞电泳法测定受试菌表面电荷的变化按文献（王金发，何炎明.细胞生物学实验教程.北京：科学出版社，2004.9，69-72）所述的方法处理。3.5 TBA法测定受试菌脂质过氧化程度取1.5ml制备的受抑菌样品，立即加入2ml浓度为20%的三氯醋酸溶液和lml浓度为0067%的TBA溶液（1%的NaOH配置），混匀后于沸水浴中煮10min，取出冷却，3000rmin离心10min，取上清液于532nm处以样品空白调零测各样品管的光吸收值3.6 受抑态菌与正常菌蛋白表达的差异3.6.1将上述3.2.3收集到的菌体用1mL PBS重溶后超声5min（总时间5分钟，超声时间5秒钟，暂停时间5秒钟）。3.6.2超声后的菌液12000r/min离心3分钟。各管取上清装入另外的管中，编好编号（待电泳）。沉淀用0.3mL PBS重溶（待电泳）。3.6.3电泳采用SDS-PAGE。按文献分子克隆与实验指南第二版所述方法处理。4实验结果记录4.1 分光光度法测定WBE的抑菌率每组取两管，编号依次为16。其中，1和2是空白对照组，即不加WBE而加等量的生理盐水；3和4是以双蒸水制取的WBE组；5和6是以PBS制取的WBE组。测定它们在600nm下的OD值并根据图1换算成菌量，结果如表1所示。 表1 WBE抑菌率检测结果编号OD值各组平均菌量（109个/ml）抑菌率（）11.9221.5340.0021.91331.6741.34412.3841.68651.6811.34512.3361.681*抑菌率（实验组菌量对照组菌量）/对照组菌量100 4.2 细胞电泳测定受抑菌表面电荷变化（各管编号所代表的意义如4.1）其结果如表2所示。表2受抑菌表面电荷变化检测结果编号泳动时间（s/10个细胞）EMP变化率（）170.13.480.0272.2350.85.1447.7445.8546.25.2250.0648.7 *变化率（实验组EMP对照组EMP）/对照组EMP100S/T *EMP= （S：泳道长88m*4；T：电泳时间；V：电压60V；L：电极间距离4.2） V/L 4.3TBA法测定受抑菌脂质过氧化程度（各管编号所代表的意义如4.1）其结果如表3所示。 表3 脂质过氧化程度检测结果编号OD值各组平均OD值差异率（）10.2900.2880.020.28530.5230.47063.3040.41650.3900.15125.9160.334*差异率（实验组OD对照组OD）/对照组OD100 4.4受抑菌与正常菌蛋白表达的差异SDSPAGE电泳结果如图2所示。其中，A/B/C为BT超声破碎并离心后用PBS重溶的蛋白组分；D/E/F为BT超声破碎并离心后的上清液的蛋白组分。A/D为空白对照菌；B/E为用双蒸水制取的WBE组的受抑菌；C/F为用PBS制取的WBE组的受抑菌；G/H分别为用双蒸水和PBS提取的WBE经离心后上清液中的蛋白组分。 图2 SDSPAGE电泳结果(注：为了方便比较显示，少数泳道用制图工具移动了在胶上的位置，如G/H泳道即是从胶的另一侧称动过来的。A/B/C，D/E/F为相邻的泳道。)5结果讨论与分析5.1 WBE的抑菌率分析以双蒸水制取的WBE组抑菌率为12.38%，以PBS制取的WBE组抑菌率为12.33%，二者相当的接近，因此可以初步的认定WBE的水提液与PBS提液总的抑菌效果相当。本次实验中两个实验组的抑菌率都不是很高，这与我们最初的纸片扩散法平板抑菌实验的结果差距较大。推测可能的原因主要是样品存放时间太长。由于我们做了多次的预实验，而所采用的WBE样品是一次制备的，因此，数次实验的时间跨度很大。而又由于实验条件的限制，我们没有蛋白酶抑制剂以及-70的冰箱可供保存样品。几次预实验的结果抑菌率一次比一次降低，也同一个侧面说明我们的推理有一定的可能性。5.2 WBE作用下BT菌表面电荷的改变分析以双蒸水制取的WBE组BT菌表面电荷变化量与PBS制取的WBE组BT菌的表面电荷变化量极为接近，均接近于50%，可见两种提液在改变细胞表面电荷方面的作用也是相当的，而且较为强烈。这种表面电荷的改变，可能是由于膜组分如膜蛋白含量的改变造成的，也有可能是其结构发生了改变或大分子物质吸附在细胞的表面。运用细胞电泳技术，结合其它实验技术，对研究细胞结构的表面性质，推测其构造和功能都有重要意义。本实验证明了在WBE作用下受抑菌的表面电荷发生了显著改变，因此很有价值沿此方向作深入的探索。5.3受抑菌脂质过氧化程度的比较分析双蒸水制取的WBE组与PBS制取的WBE组的脂质过氧化程度分别比对照组高63.30%和25.91%，二者都有较高的促使BT菌脂质过氧化作用。水提液的效果是PBS提液的效果的三倍多，在促脂质过氧化方面二者差异极显著。对于红火蚁毒素抑菌的有效成分的争论，直到今天都尚未得到共识，有的学者认为抑菌的主要成分是生物碱哌啶，也有的认为是毒素中所含的毒蛋白（目前共分离出五种蛋白，分别命名为soli 1-5）产生的抑菌效果。在我们的实验中，水提的WBE液中几乎不含蛋白或含极少量的蛋白，PBS提液中含有少量的蛋白（见图2中的G/H泳道）。这两个实验组在总的抑菌效果及细胞电泳方面几无差异，但是在促脂质过氧化能力方面差异极显著。因此，我们认为，红火蚁毒液中的哌啶与毒蛋白均有一定的抑菌作用，但它们作用的途径有相同也有不同。5.4受抑菌BT全蛋白的SDS-PAGE电泳谱的比较分析由于条件的限制,无法得到蛋白酶抑制剂和在从中大到比赛现场的途中没有冷冻设备。我们的WBE样品存放时间过长（48小时）；在无蛋白酶抑制剂保护的条件下保存；也无-20的冰箱可供保存样品，导致我们部分蛋白的降解。这可能是我们最终电泳结果不清晰最主要的原因。我们实验的目的是进行是受抑菌的全蛋白测定，每种蛋白的表达量并不高，也会引起带不清晰。另外，加样量为10L，相对偏少，一些含量较少的蛋白无法显现出来也可能是导致电泳条带不够清晰的原因之一。由于比赛时间限制，在脱色的时候我们选择了在45高温脱色（见分子克隆与实验指南第二版），但是这种方法也会使蛋白带有所变浅。这些都是由于我们实验经验仍显缺乏，设计方案不够成熟造成的。非常感谢华农的老师在这些方面给予我们的指点以及提供了她们宝贵的实践经验。虽然加样量偏少，但是根据我们所获得的电泳图谱，仍然可以分析出几种高含量蛋白表达上的差异（见图2）。在用PBS重溶的A/B/C组中，可以明显看出，空白对照组（A）的BAND 1/BAND 2/BAND 3这三种蛋白的含量都比实验组B/C高。水提的WBE组（B）各种蛋白含量都较A/C少，而PBS提取的WBE组（C）大多蛋白含量介于A/B之间，但BAND 4蛋白含量却是最高。在超声破碎并离心取得的上清液中，蛋白含量显著少于用PBS重溶沉淀的蛋白量，只能看到BAND 2/BAND 3这两条含量最大的蛋白带，且丰度为DFE(即实验组蛋白含量都少于对照组)。即各组WBE提液均使其上清中的蛋白表达量降低了。5.5对红火蚁毒素抑菌作用机理探索的总结从上面各项实验可以看出，红火蚁毒素的杀菌/抑菌作用机理较为复杂，不是通过单一的途径而是多渠道共同作用的结果。例如，使受试菌的表面电荷量大大增高；使受试菌发生脂质过氧化；也可通过影响基因表达造成蛋白谱的差异，从而影响其生理活性。当然，其可能的抑菌途径可能还有很多，即使以上几个途径我们的研究也尚未完全阐明，仍有待进一点的挖掘探索。6参考文献1李德山，李建光。红火蚁生物学特性及其防治。植物检疫，2005，19（2）：93-952 Kevin L.Haight,Walter R. Tschinkel.Patterns of venom synthesis and use in the fire ant,Solenopsis invicta.Toxicon 42(2003)673-6823 Harold Baer, T. -Y. Liu, Martha C. Anderson. Protein components of fire antvenom (Solenopsis invicta).Toxicon,Volume 17, Issue 4 , 1979, Pages 397-4054 Gordon B. Strom, Jr. M.D. In vivo and in vitro comparison of fire ant venom and fire ant whole body extract.Journal of Allergy and Clinical Immunology.Volume 72, Issue 1 , July 1983, Pages 46-535 Greggory K. Storey, Robert K. Vander Meer. Effect of fire ant (Solenopsis invicta) venom alkaloids on the in vitro germination and development of selected entomogenous fungi.Journal of Invertebrate Pathology.Volume 58, Issue 1 , July 1991, Pages 88-956廖坤宏,曹源浩,李艳芳.红火蚁全蚁浸出液对几种病原细菌和真菌的抑制作用.未正式发表7薛大勇，李红梅，韩红香等。红火蚁在中国的分布区预测。昆虫知识，2005，42（1）：57-618 Michael J. Killion *, William E. Grant. 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Strom, Jr. M.D. In vivo and in vitro comparison of fire ant venom and fire ant whole body extract.Journal of Allergy and Clinical Immunology.Volume 72, Issue 1 , July 1983, Pages 46-5316 /20051021/n227269118.shtml17林圣，曹源浩，廖坤宏.人工干预的区域微生境内红火蚁（Solenopsis invicta）发生的时相规律及分布特性.尚未正式发表.18赵国华.TBA法测定肉的脂氧化.肉类工业. 1998，207（9）19杨彪,龙盛京,覃振江,周江道.苦丁茶提取物抗氧化作用的研究.广西民族学院学报(自然科学版)，6（2），200020王金发，何炎明.细胞生物学实验教程.北京：科学出版社，2004.9不同品牌香烟对维生素C的破坏作用比较 中山大学 生命科学学院 03生物技术应用 吴浩佳中山大学 生命科学学院 03生物技术应用 姚海兴中山大学 生命科学学院 03生物技术应用 张 洁 1实验目的1.1 证明香烟烟雾对维生素C的破坏作用；1.2 比较不同品牌香烟对维生素C的破坏作用；1.3 探索模拟人体吸收香烟燃烧烟雾的最佳装置。2. 实验原理吸烟是复杂的氧化应激因素，直接或间接产生的大量活性氧自由基(ROS)不仅使机体氧化负荷增加，还能损伤机体的抗氧化系统。维生素C是经典的抗氧化剂，能够减轻多种因素所致的氧化损伤香烟烟油和烟雾中含有大量自由基，每口烟雾约含10141016个自由基，如烷类自由基、多聚苯氧自由基等，这些自由基以及尼古丁和烟雾中的氧化物质、焦油等成分会破坏体内的维生素C。有研究指出：将67名不吸烟的人置于烟雾缭绕的环境中，结果显示，那些每天服用500毫克维生素C的人所受的伤害很小，被动吸烟会对人体造成氧化损害，但这种损害能被维生素C中含有的抗氧化剂所抵消。据统计，每吸一支烟约消耗掉25毫克维生素 C；如果是被动吸烟，维生素 C的损耗量更大，甚至高达50毫克。吸烟可以阻止人体对维生素C的吸收，尼古丁对维生素C更有直接的破坏作用。 维生素C又称抗坏血酸，分子式C6H8O6，相对分子质量为176.12。包括L抗坏血酸和L脱氢抗坏血酸，两种抗坏血酸在一定条件下可以相互转化（如图）。维生素C属于水溶性维生素，由于其强还原性，可以用I2标准溶液对其进行直接滴定。维生素C中的烯二醇基被氧化成二酮基。其滴定反应式： 因此，将香烟燃烧烟雾溶于水中配成水溶液，通过计算在烟雾水溶液处理后维生素C的减少，对不同香烟进行比较，可以推断不同品牌香烟有害成分的相对含量，并可以以此来作为鉴定不同香烟品牌的一个指标。由于维生素C的还原性很强，较容易被溶液和空气中的氧氧化，在碱性介质中这种氧化作用更强，因此滴定宜在酸性介质中进行，以减少副反应的发生。考虑到I2在强酸性中也易被氧化，故一般选在PH为3-4的弱酸性溶液中进行滴定。3实验操作步骤3.1 香烟烟雾溶液的制备3.1.1 按图所示安装好仪器，如图所示，香烟接在T形管的C端，注射器接在T形管的B端，T形管A端接100mL锥形瓶，内盛50mL 0.9%生理盐水；3.1.2 吸烟时，各支管均打开，持续5秒后，将C端封闭，将针筒内的气体打出，同时摇动锥形瓶，使烟雾充分溶于生理盐水中，持续55秒，即每吸一次烟为1分钟。将三种不同品牌香烟（红玫王、白沙、椰树）每种各抽取2支； 3.2 烟雾溶液维生素C混合液的制备3.2.1 维生素C溶液的制备称取1.5g抗坏血酸粉末，加入新煮沸并冷却的蒸馏水使其溶解，定量转移至500mL容量瓶中，定容，备用；3.2.2 烟雾溶液维生素C混合液的制备 图1分别从每种香烟的烟雾溶液中取5mL、15mL、20mL于50mL容量瓶中，分别加入25mL新配制的维生素C溶液，用生理盐水定容至50mL，备用；3.3 直接碘量法测定维生素C的含量3.3.1 c(1/2I2)=0.1mol/L I2标准溶液的配置和标定 c(1/2I2)=0.1mol/L I2储备液的配置将6.6g I2与10gKI置于研钵中，在通风橱中加入少量水研磨，待I2全部溶解后，将溶液转入棕色试剂瓶中，加水稀释至500mL，摇匀，放暗处保存； c(1/2I2)=0.01mol/L I2标准溶液的配置将c(1/2I2)=0.1mol/L I2储备液稀释10倍即可； c(1/2I2)=0.01mol/L I2标准溶液的标定用移液管取10mL0.01mol/L Na2S2O3标准溶液于锥形瓶中，加入8滴0.5%的淀粉水溶液，用I2标准溶液滴定至稳定的浅蓝色，30秒不退色即为终点。平行标定三次，计算I2标准溶液的浓度c(1/2I2)。3.3.2 维生素C含量的测定量取配制好的各瓶烟雾溶液维生素C混合液10mL，加入10ml2mol/l醋酸和滴0.5%淀粉水溶液，立即用0.01mol/L I2标准溶液滴定至稳定的浅蓝色即为终点。平行测定两次，计算维生素C的含量。4结果及计算4.1 计算公式 Na2S2O3的体积（10ml）0.011（mol/l）c(1/2I2)= 用于滴定Na2S2O3标准溶液的I2的体积 c(1/2I2)(对照组滴定体积实验组滴定体积)8806每支香烟破坏的维生素C(mg)= 烟液体积4.2 Na2S2O3标准溶液的浓度 表1次数用于滴定Na2S2O3标准溶液的K2Cr2O3的体积(mL)122.90222.78322.52平均值22.73 Na2S2O3的标准浓度=0.011mol/L4.3 I2标准溶液的浓度c(1/2I2) Na2S2O3的标准浓度=0.011mol/L 表2次数用于滴定I2标准溶液的Na2S2O3的体积(mL)111082111231092平均值1104 I2标准溶液的浓度c(1/2I2)=0.010mol/l4.4 维生素C含量的测定 表3 对照红玫王白沙椰树烟液(mL)0515205152051520维生素C溶液体积(mL)25生理盐水(mL)25201052010520105 用于标定维生素C的I2标准溶液的体积（ml）次数118.4517.9216.6816.0217.6115.6014.7217.4815.4414.38218.6217.9016.6416.0817.5715.7014.7017.5115.4814.41平均18.5417.9116.6616.0517.5915.6514.7117.5015.4614.40维生素C含量（mg）65.3063.0858.6856.5361.9555.1251.8161.6454.4550.72每支香烟破坏的维生素C(mg) 11.10 11.04 11.00 16.73 17.00 16.86 18.31 18.08 18.23平均每支香烟破坏的维生素C(mg) 1105 1686 1821 45 .标准曲线根据实验数据，可以得到如下图所示的标准曲线： 图25讨论与分析5.1 吸烟是复杂的氧化应激因素，直接或间接产生的大量活性氧自由基(ROS)不仅使机体氧化负荷增加，还能损伤机体的抗氧化系统。维生素C是经典的抗氧化剂，能够减轻多种因素所致的氧化损伤(刘珊等，2004)。在本实验中，由实验结果可以看出，香烟燃烧烟雾确实对维生素C有破坏作用，而且不同品牌的香烟对维生素C的破坏作用也呈现出一定差别。本实验选区的十三种品牌的香烟，即“红玫王”(售价14.5元)、“白沙”(售价5.2元）、“椰树”(售价3元)，通过比较，发现“红玫王”在这三种品牌的香烟中对维生素C的破坏作用是最小的，“白沙”其次，“椰树”对维生素C的破坏作用是最大的，这种品牌之间的差别与其售价呈一致的关系，因此可以判断，对维生素C的破坏可以作为评价不同品牌香烟优劣的一个标准。但是，我们不能判断，对维生素C的破坏作用，可以作为评价不同品牌香烟优劣的主要标准，因为香烟对人体的损害，并不仅仅体现在对维生素C的破坏作用上，更重要的是使机体的氧化抗氧化系统失去平衡，从而破坏机体的DNA和蛋白质，对机体造成损伤；5.2 本实验吸收烟雾的方法主要是模拟人体吸烟的过程，因此不会对所有香烟燃烧释放的烟雾做完全的吸收，但是为了做到三种香烟的吸收条件尽可能一致，我们采用了如下的方法，即吸烟5秒，震荡55秒，这样在最大程度上保证了三种品牌香烟的烟雾吸收条件一致，而又能够模拟人体吸烟的过程，在所查阅的文献中，我们发现有使用2秒与58秒的组合，但是，我们在实际的操作过程中发现，吸烟2秒之后的3秒钟，会有大量烟雾进入吸收瓶，因此我们对其进行了改进，以使烟雾充分得溶解于生理盐水中。在吸烟的过程中，我们使用的吸收液是0.9%的生理盐水，以模拟人体内的体液条件，但是在所查阅的文献中，也有过使用其他吸收液的报道，比如PBS(pH=7.2)(刘珊等，2004)，环己烷:甲醇:乙醇=5:3:2(赵贤四等，1997)。考虑到要使香烟烟雾溶液与维生素C充分反应，即是考虑到两者化学性质的异同，维生素C易溶于水，而难溶于有机物，我们选择了水相的生理盐水作为吸收液，并且能够最大限度的模拟人体内的反应，最后得到的溶液为淡黄色的溶液，并且三种不同品牌香烟的最终吸收液呈现的颜色不尽相同，“红玫王”吸收液的颜色相对较淡，而“椰树”吸收液的颜色则是三者中最深的；5.3 在实验准备过程中，我们发现，香烟烟雾溶液必须在第一时间内与维生素C反应，并保持维生素C与香烟反应的时间在一小时以上，原因之一是香烟烟雾溶液含有的大量氧自由基有可能在短时间内淬灭，因此快速的混合及长时间的反应能够使其充分反应；另外，我们在实验准备阶段发现，若将烟液密封放置一段时间后，但黄色的溶液逐渐变浅，因此可以判断，溶于生理盐水中的烟雾有逐渐挥发的趋势。因此，我们在吸收完香烟烟雾之后，便立刻与维生素C溶液混合，并震荡一小时左右，再用碘液对其滴定，这样得到的结果较为可靠、准确，最后的实验结果线性良好，也说明了快速混合，长时反应的必要性；5.4 对照的必要性由于维生素C在空气中极易被氧化，因此配维生素C溶液时所称量的维生素C的质量并不能够作为最终判断的结果，为了减小这个误差，需要使用新煮沸并冷却后的蒸馏水来溶解维生素C，而对照实验的设计使这种差距几乎减小到零，可以使结果更加真实、可信；由于对照实验的设计，在配置维生素C溶液时所称取的维生素C的质量也并不要求十分精确。5.5 数据分析通过对三种不同品牌香烟对维生素C的破坏的比较，发现“白沙”与“椰树”两者对维生素C的破坏作用接近，而“红玫王”对维生素C的破坏作用相对较小。有研究显示每支香烟可破坏维生素C