神经的电生理特及影响因素实验报告.doc

实验1 蟾蜍坐骨神经干复合动作电位特性*，*（浙江大学08级*）【目的】探讨神经干双相动作电位的形成机制及影响因素。1 材料蟾蜍；任氏液；BB-3G标本屏蔽盒，微机生物信号采集处理系统。2 方法21 系统连接和参数设置 RM6240多道生理信号采集处理系统与标本盒连接，1、2通道时间常数0.02s、滤波频率3KHz、灵敏度5mV，采样频率100KHz，扫描速度0.2ms/div。单刺激激模式，刺激波宽0.1ms，延迟1ms，同步触发。22 制备蟾蜍坐骨神经干标本 蟾蜍毁脑脊髓和下肢标本制备，下肢标本仰卧置于蛙板上，分离脊柱两侧的坐骨神经，紧靠脊柱根部结扎，近中枢端剪断神经干，将神经干从骶部剪口处穿出。循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟，纵向分离坐骨神经直至腘窝胫腓神经分叉处，将腓浅神经、胫神经与腓肠肌和胫骨前肌分离。置剪刀于神经与组织之间，剪切直至跟腱并剪断跟腱和神经。剥离附着在神经干的组织，坐骨神经干标本浸入任氏液中。23 实验观察231 中枢端引导动作电位 神经干末梢端置于刺激电极处，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，测定第1和第2对引导电极引导的双相动作电位正相波和负相波的振幅和时程。232 改变引导电极距离 用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干中枢端，记录引导电极距离10mm、20mm、30mm时的动作电位。分别测定上述三个引导电极距离的动作电位正相波和负相波的振幅和时程。233 末梢端引导动作电位和测定动作电位传导速度 引导电极距离10mm，神经干中枢端置于刺激电极处，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，测定第1对引导电极引导的双相动作电位正相波和负相波的振幅和时程。分别测量两个动作电位起始点的时间差和标本盒中两对引导电极之间的距离S（应测r1- r2 的间距），计算动作电位传导速度。234 单相动作电位引导 用镊子在第1对引导电极之间贴近后一电极处神经夹伤，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，测量单相动作电位的振幅和动作电位持续时间。测量单相动作电位的上升时间和下降时间。235 按0.02V步长，刺激强度从0V开始逐步增加至动作电位不再增大止。测量动作电位振幅与刺激电压对应数据。236 换一神经干，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，若第2对引导电极引出一双相动作电位，用一小块浸有3mol KCl溶液的滤纸片贴附在第2对引导电极后一电极处处的神经干上。记录KCl处理前及处理后3min 第2对引导电极引导的动作电位振幅和时程。237 用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，用一小块浸有40g/L 普鲁卡因溶液的滤纸片贴附在第1对引导电极后一电极处的神经干上。记录处理前及处理后5min 第1对引导电极引导的动作电位振幅和时程。23 统计方法 结果以xs表示，统计采用Student t test方法。3 结果31 蟾蜍坐骨神经干的阈强度、最大刺激强度、传导速度引导电极距离10mm，神经干中枢端置于刺激电极处，用波宽0.1ms的方波刺激神经干，测得蟾蜍坐骨神经干的阈强度（Uth）为0.280.09（V），最大刺激强度（Umax）为0.600.16（V），传达速度（V）为22.918.04（m/s）。可以发现，除了第6组的V是个位数，显著小于其他组的结果，如将其删去，V=24.586.75，具体数据见表1。表 1 蟾蜍坐骨神经干的阈强度、最大刺激强度、传导速度Table 1 The threshold and maximal stimulus intensity and conduction velocity of sciatic nervesampleUth(V)Umax(V)V(m/s )10.210.5212.9920.480.5723.2430.260.8023.2640.310.6026.7050.340.7632.2660.210.819.6270.30.4834.4880.190.3723.2690.220.4820.41x0.28 0.60 22.91 S0.09 0.16 8.04 xs0.280.090.600.1622.918.0432 刺激强度与动作电位振幅由于没有记录本组所有按0.02V步长，刺激强度从0V开始逐步增加至动作电位不再增大止的数据，所以利用实验老师提供的原有数据进行绘制。结果为，刺激电压升高到0.3V时出现AP，电位振幅为0.17mV。刺激电压升高到1.0V时出现电位振幅为不在明显增加，为6.84mV。刺激强度与动作电位振幅的关系图见图1。图 2 蟾蜍坐骨神经干动作电位振幅与刺激强度的关系Figure 1. The relationship between stimulus intensity and action potential amplitude of sciatic nerve33 神经干中枢引导的双相动作电位正相、负相振幅及持续时间引导电极距离10mm，神经干中枢端置于刺激电极处，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，第1对引导电极测得正相振幅A1chp=3.421.75（mV），显著大于负相振幅A1chn=2.120.99（mV）（P0.001）；正相续时间D1chp=1.470.74（ms），显著小于正相续时间D1chn=2.770.61（ms）（P0.001）。第2对引导电极测得正相振幅A2chp=3.161.69（mV），并不显著大于负相振幅A2chn=1.841.28（mV）（P0.001），然而，可以发现，所有的9组结果中，除了第4、6组的结果，其他组的A2chp都大于A2chn，当删除第4组数据时，P=0.014，达到显著，当删除第4、6组数据时，P=0.005，极显著，说明在排除异常数据时，A2chp是显著大于A2chn的；正相续时间D2chp=1.810.47（ms），显著小于正相续时间D2chn=2.951.10（ms）（P=0.009）。同时A1chp与A2chp没有检测到显著性差异，A1chn与A2chn也没有检测到显著性差异。本实验具体数据见表2。表 2 蟾蜍坐骨神经干中枢引导的双相动作电位正相、负相振幅及持续时间Table 2 The amplitude and duration of center-conducted biphasic action potential of sciatic nervesampleA1chp(mV)A1chn( mV)D1chp(ms )D1chn(ms )A2chp(mV)A2chn( mV)D2chp(ms )D2chn(ms )15.76 3.26 1.162.626.60 2.131.743.1821.72 1.42 1.042.001.99 0.8921.632.3634.13 2.92 1.232.233.55 2.05 1.89 2.71 41.3580.89 3.40 3.99 2.14 4.391.4785.3255.62 3.18 1.153.063.49 1.991.562.7262.76 1.61 1.183.001.97 2.981.351.2173.24 2.06 1.182.762.34 1.2211.513.181.36 0.76 1.442.171.40 0.282.32.5294.792.961.463.134.970.6112.823.43x3.42 2.12 1.47 2.77 3.16 1.84 1.81 2.95 S1.75 0.99 0.74 0.61 1.69 1.28 0.47 1.10 xs3.421.752.120.991.470.742.770.61*3.161.691.841.28 #1.810.472.951.10注：P0.001, vs A1chp; *P0.001, vs D1chp, P=0.052, vs A2chp; P=0.138, vsA1chp, #P=0.040, vs A1chn, P=0.009, vs D2chp.34 引导电极间距离对坐骨神经干动作电位振幅、时程的影响用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干中枢端，记录引导电极距离10mm、20mm、30mm时的动作电位。分别测定上述三个引导电极距离的动作电位正相波和负相波的振幅和时程。结果发现，A10p显著大于A10n，A20p显著大于A20n，A30p显著大于A30n；A20p显著大于A10p，A30p也显著大于A10p；A20n显著大于A10n，A30却显著小于A20。另外，D10p显著小于D10n，D20p显著小于D20n，D30p显著小于D30n；D20p显著大于D10p，D30p也显著大于D10p；D20n显著大于D10n，D30也显著大于D20。具体数据见表3、表4。表 3 不同的引导电极间距离下双相动作电位的振幅(mV)Table 3 The amplitude of biphasic action potential at different interelectrode distancessampleA10pA10nA20pA20nA30pA30n19.604.3612.388.3512.0210.5027.385.479.315.399.833.31310.457.1312.608.1612.854.7444.652.646.053.536.001.7259.674.8613.788.3313.956.0669.725.2811.315.4011.634.9677.503.379.654.499.893.8187.383.408.383.158.521.00910.975.8614.638.6014.856.47x8.594.7110.906.1611.064.73S2.011.422.772.222.792.83xs8.592.01*4.711.42#10.902.776.162.2211.062.794.732.83 注：*p0.001, vs A20p; #p0.001, vs A10p, P0.001, vs A20n; P=0.012, vs A10n, P0.001, vs A10p, P0.001, vs A30p, P=0.014, vs A20n.表 4 不同的引导电极间距离下双相动作电位的时程(ms)Table 3 The duration of biphasic action potential at different interelectrode distancessampleD10pD10nD20pD20nD30pD30n10.89 2.49 1.23 2.62 1.36 2.82 21.15 2.58 1.40 2.81 1.46 3.84 31.29 2.05 1.28 2.19 1.35 2.87 43.35 4.04 3.53 4.29 3.53 4.55 51.20 2.91 1.38 2.69 1.56 3.13 61.02 2.57 1.17 3.02 1.45 3.23 71.21 2.43 1.30 3.61 1.58 3.52 81.31 2.28 1.73 3.51 1.98 3.30 91.28 2.41 1.38 3.34 1.49 3.48 x1.41 2.64 1.60 3.12 1.75 3.42 S0.74 0.57 0.74 0.63 0.69 0.53 xs1.410.74*2.640.571.600.74# 3.120.631.750.693.420.53注：*p0.001, vs D10n; #p0.001, vs D30p, P=0.024, vs D30p; P0.001, vs D30p; P=0.011, vs D20n; P=0.001, vs D10p; P=0.001, vs D20p.35 神经干末梢引导的双相动作电位与单相动作电位的振幅及持续时间引导电极距离10mm，神经干中枢端置于刺激电极处，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，测得双相动作电位正相振幅Abp=8.912.33（mV）显著大于负相振幅Abn=5.472.30（mV）；正相持续时间Dbp=1.320.45（mV）显著小于负向持续时间Dbn=2.680.58。用镊子在第1对引导电极之间贴近后一电极处神经夹伤，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，测量单相动作电位的振幅Am=9.953.07（mV）与Abp无显著性差异，持续时间Dm=2.270.57（ms）显著大于Dbp。然而，观察可发现sample 1中Am显著地比Abp小，与总体趋势不符，删掉这个数据，Am变显著地大于Abp（P=0.003）。表 5 蟾蜍坐骨神经干末梢引导的相动作电位与单相动作电位的振幅及持续时间Table 5 The amplitude and duration of ending-conducted biphasic and monophasic action potential of sciatic nervesampleAbp(mV)Abn(mV )Dbp(ms )Dbn(ms )Am(mV)Dm(ms)112.0210.51.362.828.181.8827.134.961.122.78.651.99310.45 7.13 1.29 2.05 12.752.0244.513.372.494.054.473.6159.674.861.22.9112.462.1269.725.281.022.5711.752.2577.873.521.032.249.752.187.653.321.292.387.451.75911.146.251.12.4314.072.73x8.91 5.47 1.32 2.68 9.95 2.27 S2.33 2.30 0.45 0.58 3.07 0.57 xs8.912.335.472.30*1.320.452.680.58#9.953.072.270.57注：*p=0.003, vs Abp; #p0.001, vs Dbp, P=0.091, vs Abp; P0.001, vs Dbp.36 单相动作电位的上升时间和下降时间此项目试验中未测量，数据暂无。37 KCl处理前后动作电位振幅及持续时间换一神经干，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，若第2对引导电极引出一双相动作电位，用一小块浸有3mol KCl溶液的滤纸片贴附在第2对引导电极后一电极处处的神经干上。观察到处理前后正相振幅AKp及正相持续时间DKp没有显著差异，而处理后的负向振幅AKn=0.570.70（mV）显著小于处理前的1.560.87（mV）（P=0.007），处理后的负向持续时间DKn=1.971.34（ms）显著小于处理前的3.080.55（ms）（P=0.013）。表 6 3mol/L KCl对坐骨神经干动作电位振幅和时程的影响Table 6 The amplitude and duration of biphasic action potential of sciatic nerve dealt with KClsampleAKp(mV)AKn(mV )DKp(ms)DKn(ms )control2mincontrol2mincontrol2mincontrol2min14.965.282.820.001.511.653.330.0022.202.540.880.661.641.792.152.2332.742.752.441.001.821.692.591.6943.553.552.222.223.503.374.053.8554.142.642.050.431.671.582.942.0961.981.780.380.221.952.523.322.671.912.341.050.451.501.873.313.5481.831.610.590.192.102.003.361.7394.134.451.650.001.942.992.700.00x3.05 2.99 1.56 0.57 1.96 2.16 3.08 1.97 S1.17 1.22 0.87 0.70 0.61 0.65 0.55 1.34 xs3.051.172.991.22*1.560.870.570.70#1.960.612.160.653.080.551.971.34注：*p=0.395, vs control of AKp; #p=0.007, vs control of AKn; P=0.083, vs control of Dkp; P=0.013, vs control of DKn.38 普鲁卡因处理前后动作电位振幅及持续时间用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，用一小块浸有40g/L 普鲁卡因溶液的滤纸片贴附在第1对引导电极后一电极处的神经干上。有实验结果可知，普鲁卡因处理后正相振幅（App）、正相持续时间（Dpp）、负向持续时间（Dpn）都显著大于处理之前，而负向振幅（Apn）显著小于处理前。表 7 40g/L普鲁卡因处理前后动作电位振幅及持续时间Table 7 The amplitude and duration of biphasic action potential of sciatic nerve dealt with procainesampleApp(mV)Apn(mV )Dpp(ms)Dpn(ms )control5mincontrol5mincontrol5mincontrol5min17.217.304.843.220.750.861.811.9927.239.365.173.601.031.161.973.6137.4710.064.424.691.281.442.232.4743.724.102.221.8443.363.423.863.98511.1912.025.915.890.971.022.242.4465.466.422.111.5751.311.382.893.6975.726.082.911.3431.121.262.332.3383.453.811.950.701.121.542.12.8999.4010.414.643.051.161.271.932.17x6.76 7.73 3.80 2.88 1.34 1.48 2.37 2.84 S2.51 2.89 1.50 1.69 0.77 0.76 0.64 0.74 xs6.762.517.732.89*3.801.502.881.69#1.340.771.480.762.370.642.840.74注：*p=0.005, vs control of App; #p=0.003, vs control of Ann; P=0.003, vs control of Dpp; P=0.014, vs control of Dpn.39 双相动作电位正、负波的叠加点按照理论分析，结合具体实验数据，可得，当最快的动作电位传达到负引导电极时，为正负波的叠加点。由此可得，电极间距离10mm时，正、负波的叠加点在正相波起始后10(mm)/22.91(mm/ms)=0.436(ms)，同理可得电极间距离20mm、30mm时，正、负波的叠加点在正相波起始后0.872(ms)、1.309(ms)。4 讨论41 神经干动作电位不具有“全或无”性质结合表1及图1可以发现，当刺激强度低于Uth=0.280.09（V）时，无法引发动作电位，当刺激强度介于Uth和Umax=0.600.16（V）之间时，随着刺激强度的增加，动作电位的振幅也随之增加，而当刺激强度高于Umax时，再增加刺激强度，动作电位的振幅便再无显著性变化，由此可得，神经干动作电位不具有“全或无”性质。这是因为实验选取的蟾蜍坐骨神经神经干由许多神经纤维组成，故神经干动作电位与单根神经纤维稍微动作电位不同，神经干动作电位是由许多不同直径和类型的神经纤维电位叠加而成的综合性电位变化，称复合电位1。神经干动作电位幅度在一定范围内可随刺激强度变化而变化。将刺激的持续时间和刺激强度对时间的变化率固定，通过测定能使细胞或组织发生动作电位的最小刺激强度，即阈强度，相当于阈强度的刺激称为阈刺激，即Uth2。当刺激强度上升的一定程度，动作电位的强度不再上升，这个强度的刺激称为最大刺激强度，即Umax。42 两引导电极处兴奋的神经纤维多寡不是引起BAP正相大于负相的主要因素从表2与表5中可以发现，在刺激、电极间距离相同的情况下，不论是中枢引导还是末端引导，BAP的正相振幅都大于负向振幅。由于神经纤维具有绝缘性，同时动作电位在同一个细胞上的传播是不衰减的2，同时坐骨神经从从中枢到末梢，其内涵神经纤维的数量会由于分支而减少，所以中枢引导时，两电极处兴奋的神经纤维数量一致，而末端引导时，正极处兴奋的神经纤维不小于负极处，由此可见，两引导电极处兴奋的神经纤维多寡不是引起BAP正相大于负相的主要因素。43 神经纤维传导速度不同不是引起BAP正相大于负相的主要因素从表1中可以看到，由于各种原因，大家制备的神经干的传导速度各有不同，但是不论是从表2还是表3来看（排除个别错误数据），BAP的正相振幅都大于负向振幅。此外，由于神经干有许多神经纤维组成，不同类型的神经纤维传导速度不同，加上坐骨神经样本会由于神经纤维的分支及取样时的损伤而具有异质性，所以可以认为坐骨神经样本不同部位的神经传导速度是不一样的。在这样的基础下，可以发现，不论是改变引导电极位置（表2及表5），还是改变电极间的间距（表3），BAP的正相振幅都大于负向振幅。所以可以说明神经纤维传导速度不同不是引起BAP正相大于负相的主要因素。既然4.2与4.3的讨论否定了神经纤维多寡与神经纤维传导速度不同这两种原因，那到底是什么原因造成BAP正相大于负相呢？要说明这一现象，需要通过“迁延效应”来解释。迁延效应即即神经干兴奋后, 有一综合波长（），当传导一定距离后, 因各神经纤维传导速度不同，将拉长，即与传导距离有关。根据迁延效应，当兴奋通过两电极间这段距离时，第一记录点神经纤维同步兴奋数目较多，因而记录到的动作电位第一相峰值较高。由于各纤维兴奋传导速度不同，第二记录点神经纤维同步兴奋数目较少，因此记录到的动作电位的第二相峰值较低但持续时间长3。这个理论一可以通过对表3、表4的分析来验证（具体分析过程见讨论4.4）。在电极间距离增大初期（约2cm）以双相电位的抵消作用为主，复合动作电位双相峰值增大。随着距离继续增大，抵消作用减弱，表现为迁延效应的现象，第二相峰值开始减小，电位持续时间延长。44 BAP是由不对称正相波和负相波叠加而成首先，用镊子在第1对引导电极之间贴近后一电极处神经夹伤，用刺激电压1.0V，波宽0.1ms的方波刺激神经干，双相动作电位变成了单相动作电位，这就说明了BAP是可以拆分成正极引导的正相波和负极引导的负向波的。虽然没有测量单相动作电位的上升时间和下降时间，但是从实验中的观察发现，双相动作电位中不论是正相波还是负相波，波形的上升时间都小于下降时间；单相动作电位波形的上升时间也小于下降时间。这说明正相波和负相波是不对称的。而这种不对称也是由“迁延效应”造成的。其次，在表5中可以发现，Dm显著大于Dbp，并且当删掉sample 1中的数据时，Am变显著地大于Abp（P=0.003）。这说明在电极间距10mm时，正相波与负向波的叠加区域较大，负向波的起始时间点位于正相波的峰值处之前，所以在而这融合后造成了正相波正相振幅和持续时间的减小。然后再看表3，表4。可以发现随着电极间距离从10mm，增加到20mm，再增加到30mm，动作电位正相、负相的振幅与时程均显著地增大，只有A30n显著地小于A20n。这说明随着电极间距离的加大，正相波与负向波的叠加区域逐渐减小，两者叠加造成的振幅和时程减小的影响逐渐减轻。这也从另一个角度说明了BAP是由正相波和负相波叠加而成的。而A30n显著地小于A20n是这一变化过程中，迁延效应造成的An的减小超过了双相动作电位抵消减少产生的An的增加，也或者是电极距离从20mm增加到30mm时，负向波的峰值已经离开叠加区域，在迁延效应的作用下，An显著减小。可以证明是成立的是前一种假设。因为单相动作电位振幅（表5 Am）显著大于双向动作电位时正相波的振幅（表3 A30p）（P=0.012，排除表5中错误的sample 1后，P=0.006），所以电极间距离30mm时，负向波依然抵消了一部分的正相波的峰值。图2是基于本小组数据及全班统计值的示意图。如果条件允许，进一步加大电极间距离的话，应该可以看到正负相波分离，这样就可以更好地验证这个理论。但此次试验坐骨神经的长度有限，难以达到这样的要求。10P、20P、30P的波形从单相波分离出来的点就是正负波的叠加点，如图2所示。同时可见，随着电极间距离的增大，正负波的叠加点逐渐后移。叠加点的具体数值计算可见结果3.9。图 2 3mol/L BAP是由正相波和负相波叠加而成Figure 1. BAP is the superposition of positive wave and negative wave 注：10p、20p、30p分别对应电极间距离10mm、20mm、30mm时的双相波形图；m为电极间距离10mm时的单相波形图。45 40g/L普鲁卡因处理神经干后发现，BAP的正相振幅和时程增加，负相振幅减小而时程延长。这是由于后一电极传导阻滞造成的。因为普鲁卡因是一种麻醉药，作用于外周神经，能制止和阻滞神经冲动的产生和传递，使神经组织的膜面稳定，减少钠离于的通渗，使正常的极化与去极化交替受阻，神