血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳七部分.docVIP

成 绩：教师签名： 生物化学实验设计 姓 名学 号专业班级任课教师实验题目：血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的：学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理，测定人血清中各种蛋白质的相对含量。2、 实验原理醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：电泳后区带界限清晰；通电时间较短（二十分钟至一小时）；它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同，在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH 缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。醋酸纤维薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH 和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸 盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM 经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、1、2、球蛋白5条区带，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。三、实验仪器与设备醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔3、 实验材料4、 （一）、材料：人血清（二）、药品巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B 染色液；漂洗液；95乙醇45ml 、冰醋酸5ml ；蒸馏水50ml ；洗脱液 0.4mol NaOH ；透明液；无水乙醇：冰醋酸7：3五、实验步骤：1、仪器与薄膜的准备（1）醋酸纤维薄膜的选择与润湿用镊子取一片薄膜，在距醋纤膜一端1.5cm 用铅笔作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，小心放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮在液面的薄膜在1530秒内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此薄膜均匀可以用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹或斑点，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。浸泡于缓冲液中约30分钟，当完全浸透后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，方可用于电泳。（2）电泳槽的准备将电泳槽置于水平平台上，将缓冲液注入电泳槽中，两边的电极槽缓冲液的高度要在同一平面。根据电泳槽支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在电泳槽的两个膜支架上, 各放2层滤纸条, 使滤纸一端的长边与支架前沿对齐, 另一端浸入电极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后, 用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡, 使滤纸的一端紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。2、点样将点样器先在白瓷反应砖上的血清中沾一下，点样前应在滤纸上反复练习，此步是实验的关键，掌握点样技术后再正式点样是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节。薄膜浸泡于缓冲液中约30分钟后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）， 再在膜条一端23厘米处轻轻水平落下并随即提起，使血清完全深透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。3、电泳用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸上，点样面朝下，另一端平贴在阳极端支架上。若膜条与电泳方向不平行, 则图谱不整。膜条与滤纸桥之间压严, 使膜条绷直, 中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时, 膜条间应相距13mm , 使之不互相接触, 以免相互干扰。盖严电泳室, 平衡10分钟后方可通电, 否则分离不好。正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V ，电流强度0.40.7mA/cm膜总宽。电泳时间约为25分钟。4、染色电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液510分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。5、漂洗从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入盛有漂洗液的培养皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。6、透明将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23分钟后取出平铺在玻璃板上, 用一直径0.5cm 的玻璃棒将其间的气泡赶出, 两者之间不能有气泡。干燥后此透明薄膜, 区带着色清晰, 可用于光吸收扫描, 长期保存不褪色。7、定量将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入04mol NaOH4ml, 于37水浴20分钟(不时振荡) ，待颜色脱净即用波长620nm 比色，以空白管调零，读各管吸光度。计算： 吸光度总和(T)=A 清+1A +2A +A +A (吸光度)六、实验预期结果：血清蛋白组分的相对百分数： 正常值清蛋白% = A 清/T100% 54731球蛋白 = 1A /T100% 2.785.1% 2 球蛋白= 2A /T100% 6.310.6%球蛋白% = A %/T100% 5.2%11%球蛋白% = A %/T100% 12.5%20%7、 实验讨