细胞房工作守则.doc

细胞房工作守则一、 常规操作1. 穿着专用实验服。自己的白大衣或厚外套，可脱在门外的衣帽架上。2. 穿着专用拖鞋。在缓冲间换下自己的鞋子，尽量避免在缓冲间走动、停留。3. 细胞房最多可4个人同时使用。尽量避免在内长时间逗留、交谈。二、 培养箱使用规则1. 从培养箱取放物品前，用酒精清洁双手（或手套），尽量缩短开门时间和减少开门次数。* 培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。长时间敞开或频繁开关培养箱，容易造成污染。2. 培养瓶皿放入培养箱前，用酒精消毒表面，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。3. 2-3人共用一层培养箱，按预定位置摆放培养器皿，方便查找，以免长时间敞开培养箱。4. 普通培养中的细胞，若非实验需要，每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次，2人以上共用的细胞，可约好时间一起观察。* 频繁将细胞拿出观察，容易给培养箱造成污染，同时也会影响细胞生长条件的恒定。三、 显微镜使用规则1. 显微镜使用前，用酒精棉从中间至周围擦拭载物台。2. 离开细胞房时或较长时间不需使用时，及时关上电源，延长灯泡寿命。尽量避免频繁开关显微镜电源。四、 超净台相关操作规则1. 超净台使用遵循预约原则。无预约者若有必要在他人预约时段内使用，需先征得预约者的同意，否则应无条件让出工作台，以免耽误他人实验。2. 超净台使用前用紫外灯照射15分钟灭菌，使用前、后需用酒精棉球擦拭工作区消毒，所有物品放入超净台内使用前均应消毒。3. 点燃酒精灯前需检查瓶中酒精是否足够，液面应占瓶高1/3-2/3。* 消毒用75%的酒精，酒精灯用95%的酒精，向喷壶或灯内添加酒精时请留意。* 酒精和酒精棉球由值日生负责补给，发现细胞房内存放量不足时请及时通知值日生。4. 超净台中应摆放废液杯和废品杯各一只，用于暂时存放废弃物，实验结束后将杯内垃圾倒入水池或垃圾桶中，并冲洗晾干备用。* 将废弃的枪头、管子内的残留液体打（倒）入废液杯后再弃入废品杯中，以免垃圾桶内留有大量培养液滋生细菌。5. 可回收的移液管、离心管、培养瓶皿等，放入装有清水的塑料桶中浸泡，桶内需有足量的清水以没过浸泡物品。* 可回收器皿必要时先初步涮洗后再放入桶内，尤其是培养瓶或血清管中有大量高营养的液体残留时，容易使桶内的清水长菌。* 保证浸泡的瓶、管内完全被清水充满，而不是在装有大量空气的情况下被压倒桶底。* 塑料桶内物品由值日生每天负责送去清洗，使用者实验结束后若发现桶已装满，请通知值日生或顺手将塑料桶带出细胞房。6. 装培养液的瓶子、配培养液的器皿勿放入塑料桶内浸泡！应由使用者本人及时清洗晾干备用。* 因桶内物品通常要浸泡几小时以上才送去清洗，此时细菌可能已在桶中生长并释放内毒素。细菌内毒素很难通过常规湿热灭菌步骤去除干净，即使干烤也不能保证其完全失活。内毒素对细胞生长及多种实验均有较大影响。* 洗涤程序：洗洁精洗净，清水冲十次以上去除洗涤剂残留，然后冲去离子水3次，再用双蒸水1次，倒置于器皿柜中晾干。关上器皿柜的门防尘。五、 培养液、试剂等相关操作规则1. 从冰箱取放物品动作要迅速，关门时要检查门是否关好。按类别存放试剂。2. 培养液母液是公用，由值日生负责配制，长期存放于-20。使用时按比例加入血清配成培养液工作液，打开使用后的母液存放于4，要注意避免污染。发现4存放的培养液量不足时及时从-20中预解冻，若-20中已没有储备，请及时通知值日生。3. 分装好的血清长时间保存于-20，使用前放于4预解冻。从-20取用血清者需登记，并在血清管上签上使用者名字，若使用别人解冻的血清需征得同意以免耽误他人实验。按需解冻，避免反复冻融。4. 原则上解冻好的血清应全部配成含血清的培养基备用，若有剩余，则暂存于4并尽快使用。尽量不要使用他人开过的血清，以免交叉污染。六、 值日生工作职责1. 每周值日生时间从周六开始，至下周五结束。2. 值日周开始时需做的事情：在周六、日或之前准备好灭菌的枪头、离心管、干烤好的玻璃器皿，供未来一周的使用。配制消毒用的75%的酒精，制作酒精棉球，给细胞房内添加足够的95%乙醇供酒精灯使用。* 新离心管灭菌前，先用去离子水过2-3次，再用双蒸水冲1次，烘干后用牛皮纸包好、灭菌。* 75%的酒精可用750ml95%的酒精加去离子水至950ml配制而成。3. 值日周内每天需做的事情：开大紫外灯消毒细胞房15-30min；将装满浸泡物品的塑料桶拎出细胞房送洗，并将空桶放回细胞房；更换垃圾袋；检查培养箱内水量是否足够；检查灭菌物品的储备情况，以便及时补充；检查培养液母液、血清、酒精等公用试剂的储备情况。4. 值日周结束前需完成的事情：星期五或前后一天内打扫细胞房。包括拖地，擦桌子、吊柜、清洁和整理抽屉，擦超净台、冰箱及桌上的仪器，给水浴锅加水或换水，洗细胞房专用的实验服和拖鞋，紫外消毒细胞房。切记给培养箱换MilliQ水，保证水质清洁！* 若上周值日生及时给培养箱内水槽加足水，根据经验未来一周内培养箱不会干水，但值日生仍应经常检查，以便及时发现异常情况。5. 每2周清洁一次培养箱：先将培养箱中的物品取出暂存于超净台内，对于比较敏感的细胞可以暂存于404细胞房的培养箱；将培养箱内的不锈钢板取出，包括4块横板和左右2块立着的架子，用酒精棉球清洁钢板和培养箱内壁；打开培养箱清洁内壁时动作要迅速，避免长时间敞开门使得大量不洁净空气进入，缩短过滤器的寿命；用紫外灯照射培养箱内部15min，手提紫外灯放入培养箱前要用酒精棉擦拭干净。6. 配制培养液母液：培养液有RPMI1640和DMEM两种，配方见404公共配液房；配制培养基要提前干烤量筒、烧杯、250ml血清瓶，湿热灭菌滤器、血清瓶瓶盖，国产滤膜使用前用MilliQ水浸泡15min以上或过夜。七、常用溶液的配制1、 RPMI 1640：干粉一包，碳酸氢钠 2.0g，Hepes 2.38g，青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml，搅拌1-2小时后调节pH值至7.2，定容至1L，过滤灭菌分装；2、 DMEM：干粉一包，碳酸氢钠 3.7g，Hepes 2.38g，丙酮酸钠110mg，青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml，搅拌1-2小时后调节pH值至7.2，定容至1L，过滤灭菌分装；3、 胰蛋白酶：用D-Hanks配制，浓度为0.25(W/V), 搅拌2小时后调节pH值至7.2，定容至1L，过滤灭菌分装；4、 青霉素：80万单位/瓶，加入4ml PBS，配成浓度为200000U/ml的母液；5、 链霉素：按质量体积比配制，用PBS配成浓度为200mg/ml的母液。细胞培养一般方法1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净,紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物.分装后置-20度保存;4.消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20度保存;5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上,如有高温灭菌的应按程序来菌).至少每月一次.6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次.手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,开开后应用灯先烧口,然后烧盖.用完后同样操作.整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点.复苏:1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内,约5ml左右,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养.传代: 1.贴壁细胞:对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验. 2.悬浮细胞:一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先离心500rpm,5min后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水 请问工作浓度的胰酶是不是应保存在20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是几个小时就会失去活性？ 平时放在-20度，分装在50毫升螺口管，用时拿一管放4度用。 1. 认真按照操作规程进行实验，一般不大会导致污染，很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败， 2. 粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，但我在过去的4年里一直是作原代细胞培养的，细胞娇弱，经验表明放置时间不宜过长。 3. 关于实验用品的清洗与消毒，我的经验是：用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少许清洗剂，以超声波洗涤30min左右，(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净)，捞出晾干，再在铬酸洗液中浸泡6-18h(或过夜)后，自来水清洗10-15遍，双蒸水清洗3-4遍，晾干，高压消毒后即可使用。 许多塑料制品也可以高压消毒，例如培养瓶盖，胶塞，吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了，当然如果money有限，如进口的培养板、皿等，也可以重复使用1-2次，我当时使用方法是将其完全清洁后，使用前在紫外灯下敞开照射1-1.5h即可，我做过多次，没有出现问题。塑料培养瓶由于清洗消毒不便，最好不要重复使用，如一定要重复用，可用环氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用) 在光镜下，上皮细胞通常呈“铺路石”样排布，细胞之间有拉丝现象（即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连），细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形，没有有成片生长的特性，细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变，如HeLa细胞是上皮细胞，但是在酸性培养条件下会变为梭形。 上皮细胞之间都有特征性的紧密连接（桥粒）结构，因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型，如果有紧密连接，就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜，要用细胞刮刮下来后做电镜。 此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达（cytokertin, CK）,可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的CK分子，然后进行免疫细胞化学的鉴定。 ，细胞在偏碱的情况下培养，耐受能力会逐渐下降，可能是产生脱壁现象的原因，后来我重新测了一下培养基，为7.5左右，我用灭菌的HCL调了一下，培养基颜色变成淡红透亮，再次培养，发现细胞贴壁比较好了，搏动效果也不错，因此，我以后每次培养前都要重新调好PH值，我觉得很多因素是能影响PH值的 血清质量不好，影响了细胞生长。所以，我认为以后养细胞，用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下，不一定要以参考文献为准，毕竟国产的血清质量差异比较大啊。 细胞无菌操作是关键，对于配制培养液时，有些人为了让培养粉充分溶解，搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要，一般培养基的固体组分还是易溶于水的，搅拌的时间长了会增加污染机会，虽然后来滤过除菌了，但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉？细菌的代谢是很快的，甚至在常温下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。 另外关于培养基的pH问题，一般按照说明书操作，加入所说的NaHCO3量，与预计的pH不会有什么距离，也就是说基本上不用调pH，如果相差大，要考虑三蒸水的质量是否有所下降，当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH，只是用试纸检测一下pH，观察一下培养基的颜色。 （1）东西一定要用自己的。既不要借别人的，也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范，因此相互之间串着用，很容易造成交叉污染。（2）我习惯口对口倒液体，在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单，越能防止污染。而且还能节省很多吸管。 （3）一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路，又出工作间拿东西，这样增加了污染的机会。 （4）整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了，最好不要接。我一般操作的时候将手机关了，手机声音响起，好烦躁。 （5）我一般开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水域锅那出后，最好找个毛巾插干上面的水。 （6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。用完操作台，要打扫卫生。 细胞要经常冻存，我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了，扔掉，重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下，细胞并不是因为污染了，才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。我一般是不加双抗的，只要注意，不会污染。 过滤时不要用枪吹细胞! 如果用力吹,筛网就像刀片一样,把你的细胞全部切碎! .刷玻璃器皿的过程：初洗、泡酸（一天）、自来水冲洗（10遍）、纯化水冲洗（3遍）、注射用水冲洗（3遍）。感觉过于苛刻，自来水只冲洗3遍。被老师发现后，一阵痛批，才知道这是极其关键的一步，残留的酸可能会抑制细胞生长，甚至导致细胞死亡，痛失辛苦得来的细胞，心血付之东流。无知不能无畏，一定不能大意。 做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去，要先设定计划：步骤，工具，试剂。特别是将细胞用于大规模生产时，尤其如此。eg.经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态，如果准备多了，用不完的就得重新灭菌，耗费能源、占用灭菌空间，不值得；干热灭菌需要一天的时间，当器皿准备不足时，只能干着急，错过了最佳操作时间，也许得很久才能将细胞状态再调整好。 对于骄气的细胞，我一般都是第一天处理完后，加少量培基（够盖住瓶底部），第二天换液，以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。 新配的培养基直接用很清亮，但是在20度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质，用37度水孵育没有效果，握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说，污染并不是我们想像那样容易出现，园子里很多人都问否污问题，而培养基的PH值往往被忽略，而且大多数人都习惯于一次配制1升培养基，分装成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在20度保存，很容易出现结晶，镜下看就是一些杆状的物资，有时候晃动培养基，肉眼就可以看到很多沉淀，这就需要我们在用之前好好摇匀了。二氧化碳培养箱选购常识1、为什么培养的细胞要及时传代？ 体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长。当细胞铺满培养器皿的表面时，正常的细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的对接触抑制不敏感的细胞会继续生长。如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞。2、为什么大多数细胞培养需要用二氧化碳培养箱？ 一般细胞培养液的pH在7.0-7.4之间。由于碳酸盐pH缓冲系统是一种生理pH缓冲系统（它是人体血液中最重要的pH缓冲系统），大多数培养液用它来保持稳定的pH。用粉末配制培养液时，常常需要加入一定量的碳酸氢钠。 对大多数以碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的pH，培养箱中的二氧化碳需要维持在2-10%之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。 是不是采用其他pH缓冲系统就不需要二氧化碳培养箱了呢？人们发现由于空气中的二氧化碳浓度很低，如果细胞不在二氧化碳培养箱中培养，培养液中的HCO3-会被耗尽，这样会影响细胞的正常生长。所以大部分动物细胞的培养，还是需要二氧化碳培养箱。 细胞培养液中常附加其他的pH缓冲系统，比如HEPES缓冲系统，来增加pH缓冲能力。HEPES在pH7.2-7.4之间有很强的缓冲能力，当透气的培养器皿被拿到二氧化碳培养箱外面的时候，由于空气中二氧化碳浓度很低，培养液中碳酸盐缓冲系统就会失去效果，这时候HEPES缓冲系统就能继续保持pH的稳定。3、怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件？ ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。4、二氧化碳培养箱的挑选和使用 由于动物细胞培养液一般使用碳酸盐pH缓冲系统，要求培养环境中维持一定浓度的CO2，所以动物细胞的培养一般需要CO2培养箱。 CO2培养箱采用两种不同的CO2维持系统。一种方式是通过使用空气泵，将CO2和空气按一定比例混合后吹入培养箱。另一种方式是通过一个自动的CO2检测控制系统，在检测到CO2浓度低于要求浓度时打开CO2气阀充入CO2。由于前一种方法耗费CO2而且不容易精确控制CO2浓度，先进的CO2培养箱都采用自动监控系统来维持CO2的浓度。 配有自动CO2检测控制系统的培养箱需要根据生产厂家的说明，定期做CO2浓度的测试和矫正。 CO2培养箱的隔热采用水套式和气套式两种类型。水套式需要用户在安装培养箱时培养箱壁的空间内灌入大量蒸馏水。由于水的比热容很高，水套式的优点是有助于均匀散热和避免形成冷区，以及在断电后能够比较好的减缓培养箱内温度的降低。它的缺点是由于灌入大量的水，培养箱变得非常沉重，不易搬动。有效的隔热系统和先进的表面散热元件的使用使气套式培养箱兼备了轻便性和水套式培养箱的优点，所以新型的CO2培养箱大多采用气套式。 目前大多数实验室都使用进口的细胞培养箱。虽然进口的产品质量上比较有保障，但价格很贵，而且售后服务不是很方便。国内的细胞培养箱的质量也有了很大的提高，CO2培养箱一般配一个水盘，用以维持很高的湿度。水盘内的水要定期添加，水盘也要定期清洗以避免微生物的生长。 为了减少微生物的污染，有一些CO2培养箱提供灭菌功能。有的可以加热到比较高的温度来灭菌，有的则通过让空气循环通过一个紫外线腔体的办法来灭菌，这样就灭菌时就不需要中断细胞的培养。5、超净台的挑选和使用 为了避免污染，一般的细胞培养需要在超净台上进行。用于细胞培养的超净台的洁净度一般为100级，即每立方英尺中大于0.5um的颗粒数量少于100颗，与计算机硬盘的生产环境要求相当。 在超净台内，过滤后的空气垂直由上到下，或水平由内到外稳定的流动，从而维持一个洁净的操作环境。根据气流的方向，超净台可分为垂直式层流和水平式层流两种类型。 在水平式层流型超净台内，过滤后的空气由内到外流动，在操作过程中比垂直式层流型更容易维持一个洁净的环境，减少污染的机会。但是由于气流吹向实验操作者，增