农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法.doc

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1灭菌 试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。2试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20贮存。3步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.53.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。4浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。2先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。4转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3，长势好的0.8 Pa 5。5标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Top agar混匀，平铺在1/2 MS培养基上，4保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18、RH为70%条件下培养。一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。每周浇一次1/2 PNS培养液。当幼苗长至3-4cm时，去除花序，在去除顶端花序四天后进行转化。转化前将已经开花授粉的花和种子去除干净。（3）抽滤法转化拟南芥及阳性苗筛选1活化农杆菌 ；2、以1:50比例转接到200 ml LB培养基中，28，2000rpm培养至OD600=1.2-1.6;3、4000rpm，离心15min，收集菌体；4、重悬于渗透缓冲液(1/2 MS培养基+5%蔗糖配置后在121 灭菌20 min，加终浓度0.02-0.03% SilwettL-77，振荡混匀)，以重悬渗透液为对照，调节OD600=0.8-1.0；5、将已授粉、结荚的拟南芥用消毒剪去除，倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染50 S，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。6、约30日后收获种子，将收获的转基因种子用含有0.2%的Triton X-100浸泡10 min；7、用10%的次氯酸南表面消毒10-12 min；8、灭菌水冲洗5-6次，每次约2 min；9、用水将转基因种子置于含50mg/L Kan的MS平板上，4暗培养两天；20 mg/L Hyg潮霉素筛选连续暗培养7天；10、Kan抗性筛选的种子在22，16h光照/8h黑夜光周期培养。两周后，经Kan抗性筛选的阳性植物表现良好，长势正常，而阴性植物则不萌发或不久死亡。 1 拟南芥的种植试剂配制人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合PNS营养液：每升含5ml 1M KNO3，2ml 1M Ca(NO3)24H2O，2ml 1M MgSO47H2O，2.5ml 20mM Fe.EDTA， 2.5ml 1M磷酸缓冲液（pH5.5），1ml MS 微量元素 。PNS营养液母液配方1M KNO3 101.1g1M Ca(NO3)24H2O 236.15 g1M MgSO47H2O，246.48 g20mM Fe.EDTA： FeSO4 5.57g EDTA 7.45g注意先各自配成溶液，在混合。 1M磷酸缓冲液（pH5.5）：磷酸二氢钾 130.4g 磷酸氢二钾 9.12gMS 微量元素 硼酸 0.434g 硫酸锰（MnSO4 H2O） 1.7626gCuSO4H2O 0.0798g ZnSO47H2O 0.172g NaMoO42H2O 0.0432g NaCl 0.585g CoCl6H2O 0.00129g 以上母液均配至1L种植步骤将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后光照，三天后揭膜。人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h黑暗16 h光照培养。2 拟南芥的转化试剂配制渗透培养基（一升中）：1/2xMurashige-Skoog；5% 蔗糖；0.5克 MES；用KOH调至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA 母液；200微升Silwet L-77）注意：6-BA 母液配制时用乙醇溶解。1/2xMurashige-Skoog是用MS的基本组分配制，但大量元素减半。另：经转化的拟南芥，种子收获后需在相应的抗性平板上筛选转化子转化步骤(1) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。(2) 室温5000rpm离心15分钟。(3) 弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使O.D600在0.8左右。(4) 将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株（或用抽真空的方法），盖上透明的塑料盖子或保鲜膜以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。(5) 一周后再喷洒一次，方法同上。3 转化子的筛选(1) 种子消毒：先用70%乙醇浸泡10分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次，在这步处理时最好也不时地使种子悬浮。注意：用乙醇浸泡的时间不宜过长！(2) 处理后的