微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅲ.分离和结构鉴别.doc

微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究.分离和结构鉴别中国抗生素杂志 2000年第4期第25卷 论著作者：陆群吕淑君张新宜陈永乐单位：四川抗菌素工业研究所，成都610051关键词：免疫抑制剂；S-9818；FK506；分离；结构鉴别摘要：在寻找新型免疫抑制剂的筛选中，从放线菌SIIA-9818的培养液中分离到一个有免疫抑制作用的物质S-9818，基于理化性质和光谱解析，证实其与FK506同质。 中图分类号：R979.5文献标识码：A文章编号：1001-8689(2000)04-0253-04S-9818, an immunospressant . Isolation and identificationLu Qun，Lu Shu-jun，Zhang Xing-yiandCheng Yong-le(Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu 610051)ABSTRACTS-9818, an immunosppressant, was isolated from fermentation broth of Streptomyces qianfoensis sp. SIIA-9818. By means of physico-chemical properties and spectrospectic analysis, its structure was identical with FK506.KEY WORDSImmunospressant；S-9818；FK506；Isolation；Structure identification1984年日本藤泽制药公司1发现了具有抑制各种免疫反应的活性物质FK506。它的抑制活性较环孢素强10100倍，在结构上属于大环内酯类，与属于环肽类的环孢素完全不同，其结构如图1。1993年以商品名Prograf在日本上市，并于1994年在美国上市。图1FK506的结构我们在免疫抑制剂的筛选中，从放线菌SIIA-9818的次级代谢产物中分离获得一个具有免疫抑制活性的化合物S-9818，经理化性质测定和光谱解析，证明其与FK506同质。本文报道化合物S-9818的分离和结构鉴别工作。1分离和纯化SIIA-9818菌株的发酵液过滤，滤液经大孔吸附树脂Amberlite XAD-2吸附，丙酮解吸；菌丝体用丙酮反复浸泡，合并菌丝浸泡液和解吸液，真空浓缩除去丙酮，残存水液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠脱水，真空浓缩得棕色浆状粗品。粗品上葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱， 用甲醇洗脱，用黑曲霉作检定菌跟踪监测，收集具有抑制黑曲霉生长活性的组分，真空浓缩至干。将此样品经少量甲醇-水混合液溶解，用C18反相硅胶中压柱分离，75%甲醇作洗脱剂，用黑曲霉跟踪监测，结合高效液相测定纯度(检测条件：ODS柱，流动相70%甲醇，流速1ml/min，检测波长210nm)。合并高效液相测定纯度为95%的活性组分，浓缩干燥得白色粉末。将此白色粉末溶于乙腈中，静置过夜，得到无色棱状结晶。2结构鉴别S-9818为无色棱状结晶。熔点126.5。易溶解于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚，不溶于石油醚、水。Fehling、Molish、茚三酮等反应阴性。紫外光谱呈末端吸收。红外光谱(KBr)中显示有下列特征吸收峰(cm-1)：3400(羟基伸缩振动)，3200(碳氢伸缩振动)，1700，1740(羰基伸缩振动)，1640(三级酰胺羰基伸缩振动)，1090(碳氧伸缩振动)。高分辨质谱(HRFAB-MS)显示有基峰804.494749，为M+1峰，对应分子式为C44H70NO12。质谱图还显示有822.4886较强峰，为M+H2O峰。在热重分析谱上80附近失重峰也提示有一分子水失去，说明S-9818结晶中包含有一分子结晶水，故S-9818的分子式为C44H69NO12H2O。S-9818的1H-NMR显示有3个甲氧基，与文献1，3报道的1H-NMR谱相同。13C-NMR和DEPT谱(图2)显示有7个季碳和6个烯键碳，7个季碳分别为4个羰基碳，1个连接氧的季碳和2个烯键季碳。从13C-NMR谱还可清楚看到成对出现的化学位移，显示有异构体存在，与文献1，3报道的FK506碳谱特征相同。1H-1H相关谱(图3)显示S-9818有5个自旋偶合系统。 由于CH2(40)的4.978和4.951是氢谱上唯一清楚显示的亚甲基烯质子，故连接指认从CH2(40)的氢开始，5个自旋偶合系统分别为(4.95)CH(20)(3.30)CH(21)(2.1)CH2(38)(5.69，5.64)CH(39)(4.95，4.98)CH2(40)，(4.57，4.95)CH(2)(1.8，2.01)CH2(3)(1.27，1.69)CH2(4)(1.45)CH2(5)(2.98，4.38)CH2(6)，(0.9)CH3(35)(2.15)CH(11)(1.39，2.05)CH2(12)(3.37)CH(13)(3.6，3.8)CH(14)(3.53)CH(15)(1.3)CH2(16)(1.5)CH(17)(2.0)CH2(18)，(2.7)CH2(23)(3.88)CH(24)(5.29)CH(25)(5.29)CH(26)，(5.0)CH(28)(2.2)CH(29)(0.8，1.9)CH2(30)(2.97)CH(31)(3.35)CH(32)(1.27，1.9)CH2(33)(0.9，1.56)CH2(34)，与文献1，3报道FK506的偶合系统相同。在13C-1H相关谱(HMQC)和13C-1H远程相关谱(HMBC)上(图4，5)也得到验证，综合S-9818和FK506的理化性质和光谱特性，确定S-9818的结构与FK506相同，碳谱3对照数据见表1。图2S-9818的DEPT谱图3S-9818的1H-1H相关谱表1S-9818与FK506碳谱对照数据表(CDCl3)序号S-9818FK506序号S-9818FK506C(1)168.93，168.68168.95，168.68CH(24)69.95，68.9069.99，68.89CH(2)56.57，52.7456.55，52.69CH(25)39.84，40.3739.82，40.40CH2(3)27.63，26.2027.67，26.21CH(26)77.32，77.8677.13，77.85CH2(4)21.10，20.8021.12，20.83C(27)132.34，131.73132.39，131.75CH2(5)24.55，24.4824.51，24.56CH(28)129.73，129.72129.66，129.70CH2(6)39.84，43.8639.22，43.85CH(29)34.8434.86，34.89C(8)164.62，165.76164.63，165.78CH2(30)34.7434.83，34.74C(9)196.10，192.50196.11，192.57CH(31)84.1484.15C(10)97.01，98.6097.00，98.63CH(32)73.6273.63，73.61CH(11)34.55，33.6734.56，33.62CH2(33)31.231.2，31.18CH2(12)32.67，32.5232.69，32.55CH2(34)30.5930.61CH(13)73.62，73.5073.52，73.50CH3(35)16.2016.23CH(14)72.77，72.2372.78，72.21CH3(36)20.38，19.4320.41CH(15)75.15，76.5675.14，76.54CH3(37)15.98，15.7615.96，15.78CH2(16)32.93，35.3832.91，35.44CH2(38)35.13，35.5335.11，35.55CH(17)26.20，26.0426.21，26.02CH(39)135.51，135.31135.54，135.33CH2(18)48.54，48.3548.54，48.35CH2(40)116.62116.67C(19)138.90，139.71138.94，139.81CH3(41)9.47，9.829.48，9.80CH(20)122.42，122.66122.42，122.65CH3(42)14.07，14.2114.10，14.23CH(21)52.74，52.8652.74，52.89CH3(43)56.26，56.0856.29，56.08C(22)212.59，212.46212.68，212.56CH3(44)56.95，57.5656.97，57.55CH2(23)43.28，43.8643.21，43.85CH3(45)56.5756.58图4S-9818的13C-1H相关谱(HMQC)图5S-9818的13C-1H远程相关谱(HMBC)致谢：本所李康业工程师测定红外光谱，特此感谢。作者简介：陆群：男，生于1971年，硕士，助理研究员。参考文献1 Okuhara M, Tanaka H, Goto T, et al. Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same P. US Patent 4894366，19902 Kino T, Hatanaka H, Hasimoto M, et al. FK506, a novel immunosppressant isolated from a Streptomyce