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考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量 1 1实验准备2实验实施3结果分析4结论 2 实验准备 果蔬可溶性蛋白质含量是果蔬品质和营养的重要评价指标之一 许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分 参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控 因此 果蔬组织可溶性蛋白含量的测定就显得尤为重要 3 实验准备 实验原理 考马斯亮蓝G 250在酸性游离状态下时最大光吸收在465nm 当它与蛋白质结合后变为蓝色 最大光吸收在595nm 在一定的蛋白质浓度范围内 蛋白质 染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比 通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 4 实验准备 实验原理 5 实验准备 考马斯亮蓝法 优点 灵敏度高 测定快速 简便 只需加一种试剂 干扰物质少 缺点 去污剂 十二烷基硫酸钠等干扰测定 标准曲线有轻微非线性 6 实验实施 主要仪器及试剂 分光光度计 电子天平 容量瓶25ml十个 50ml烧杯2个 BSA新鲜苹果 Tris 外援添加物等 7 实验实施 1 试剂的配制 标准蛋白溶液的制备 配制100 g mL的BSA溶液 提取缓冲溶液 pH7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 8 4 8 6 8 8和9 0梯度Tris HCl缓冲液 100mmol L 梯度浓度Tris HCl缓冲液 pH9 0 10 30 50 80 100mmol L 外援添加物 EDTA 1mmol L PVP 1g 100mL NaCl 0 15mol L 抗坏血酸 2mmol L MgCl2 0 5mmol L 半胱氨酸 2mmol L 巯基乙醇 2 V V 8 实验实施 2 实验操作步骤 称取苹果果肉1g 加入不同缓冲液5mL 研磨 离心 取上清液8mL 低温保存 9 实验实施 实验操作步骤 开启分光光度计 预热20分钟 标准溶液吸光度的测定 标准曲线的绘制 待测液的测定 10 结果分析 表一 不同吸光度值对应BSA含量 线性回归率为0 9990 线性方程y 186 33X 4 8440 11 结果分析 不同缓冲体系对可溶性蛋白提取效果的影响 1 不同缓冲液及其pH 1 11分别代表水 pH为7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 8 4 8 6 8 8 9 0的Tris HCl缓冲溶液 12 结果分析 2 不同浓度 1 6分别表示浓度为0 10 30 50 80 100mmol L的pH为9 0的Tris HCl缓冲溶液 13 结果分析 3 不同外援添加物 A J分别代表抗坏血酸 半胱氨酸 EDTA PVP 巯基乙醇 NaCl MgCl2 PVP 巯基乙醇 PVP EDTA EDTA PVP 巯基乙醇 14 结果分析 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定 15 结论 实验最终确定的适用于苹果果实可溶性蛋白含量测定的提取条件为 0 1mol L pH为9 0的Tris HCl提取缓冲液 内含1mol LEDTA和1 PVP 此条件下 果实
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