第五章食品生物技术实1.doc

第五章食品生物技术实验实验55 脉胞菌固体发酵-生产胡萝卜素1. 实验目的了解脉孢菌生长特性; 学习胡萝卜素固态发酵生产工艺。2. 实验原理 -胡萝卜素（-Carotene）是共轭双键化合物，分子式为C40H56，分子量为536.88，熔点176-180，-胡萝卜素的晶体是深红紫至暗红色有光泽的斜六面体，稀溶液呈橙黄色至黄色。遇氧、热及光不稳定，在弱碱下较稳定，是一种脂溶性色素，属于类胡萝卜素的一种。广泛存在于植物、藻类和真菌中，动物和人体内不能合成必须从外界摄入。-胡萝卜素有各种顺反不同的立体构型，全反式的结构如图1 所示。国内外生产- 胡萝卜素可通过化学合成、植物提取和微生物发酵等3种方法。微生物（真菌、细菌和藻类）发酵法生产-胡萝卜素，从品质、技术、资源和成本等因素考虑优于上述两种方法，未来此方法将是发展方向。所有类胡罗卜素的生物合成途径都是来源于类异戊二烯或类萜途径。但是大多数生物合成的类胡罗卜素是C40化合物。已经证明：类胡罗卜素的生物合成是由一系列步骤完成的，这一途径中的中间产物的数量和组成在不同的生物中可能有所变化。在真菌中，类胡罗卜素是由甲羟戊酸的生物途径合成的。甲羟戊酸的代谢物是由乙酰基变化经过羟甲基戊二酰CoA形成的。乙酰辅酶A是最初的底物前体，经过四个阶段的反应合成-胡萝卜素。其类胡罗卜素分子合成过程为3个乙酰辅酶A分子通过失去1个分子的羧基团而缩合成3,5-二羟基-3-甲基戊酸（MVA），MVA在酶的作用下形成异戊二烯焦磷酸（IPP），并异构化形成二甲基丙烯焦磷酸脂（DMAPP），再于3分子的IPP作用生成二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸（GGPP）。在GGPP的基础上，形成了八氢番茄红素，随后又逐步发生脱氢形成番茄红素（Lycopene,C40H56）,最后番茄红素再经两端的环合作用形成-胡萝卜素及其他类胡萝卜素。利用微生物发酵生产-胡萝卜素，具有条件温和、易操作、易控制、可行性强等特点。经研究发现脉孢菌的孢子中含有丰富的类胡萝卜素，其中以-胡萝卜素为主。同时，根据类胡罗卜素的生物合成途径，添加生物合成的发酵底物的前体物质，可提高-胡萝卜素的产率。脉孢菌（Neurospora sitophila ）是腐生菌，在马铃薯琼脂上生长良好。菌落最初白色、粉粒状，很快变为淡黄色、绒毛状。菌落成熟后，上层覆盖成团块的分生孢子。分生孢子聚成团，淡黄色到橙红色。菌丝体透明，四周蔓延，有横隔。生孢子的菌丝不规律地向空中生长，即气生菌丝有横隔，呈双叉式分枝。分生孢子成链，有孢隔，球形或近似球形，光滑，它的子囊有8个孢子；橘黄色到橙红色，孢子直径10-12微米。3. 实验仪器、装置与流程 菌种：脉孢菌（Neurospora sitophila ）。 仪器、装置：紫外可见分光光度计、高速离心机、净化工作台、康氏震荡器、霉菌培养箱、发酵曲盘、三角瓶。 试剂：- 胡萝卜素标样、盐酸、丙酮。 培养基及其制备： 种子培养基：查氏培养基。 发酵培养基：基础培养基(100g)：豆渣85%，麸皮添加量15%，培养基含水量为77-80%，PH自然。添加发酵前体培养基（100g）：豆渣85%，麸皮添加量15%，培养基含水量为77-80%，添加番茄汁（浓度2%）5mL，PH自然。 实验流程：脉孢菌豆渣等原料处理好氧培养二代菌发酵物干燥热酸破壁测定有机溶剂提取子孢子悬液4实验步骤及方法 种子培养：将活化完成的脉孢菌制成孢子菌悬液，转接到三角瓶直接进行发酵，或转接到三角瓶作为种曲进行扩大培养后，再转接到曲盘中进行发酵生产-胡萝卜素。 取3只500mL三角瓶，装入发酵培养基（豆渣85%，麸皮添加量15%，培养基含水量为77-80%，PH自然），装量为75g。用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎。置灭菌锅中，在0.1Mpa 下灭菌 30min。 将成熟的斜面，在无菌条件下，住入5mL 无菌水，震荡成孢子悬浮液（浓度106个/ml）。待发酵培养基灭菌后冷却到28-30C时，分别将孢子接入三角瓶中，接种量为2% ，标好记号。将三角瓶置于霉菌培养箱内，培养温度为28C，相对湿度为28下的饱和湿度，培养时间 72-96h。 发酵培养：发酵采用曲盘发酵，曲盘规格是（32152.8cm）。取灭菌后的曲盘6只,其中3只分别装入灭菌后的发酵基础培养基（豆渣85%，麸皮添加量15%，培养基含水量为77-80%，PH自然）；另外3只分别装入添加发酵前体培养基（豆渣85%，麸皮添加量15%，培养基含水量为77-80%，添加番茄汁（浓度2%）5mL，PH自然），装量分别为500g。将发酵后的三角瓶种子，按照10%的接种量均匀地接入曲盘中，接种后曲盘中的发酵培养基尽量平整，并在曲盘上面盖上四层无菌纱布放置霉菌培养箱内，培养温度为28C，相对湿度为28下的饱和湿度，培养时间 120h。每隔24h观察发酵生长状态，发酵结束后，进行-胡萝卜素的提取及测定。 -胡萝卜素的提取：脉孢菌固态发酵生产-胡萝卜素，其产物存在于孢子中，故提取必须经过破壁处理。实验采用热酸破壁法。-胡萝卜素的破壁和提取的原理： 脉孢菌的孢子壁结构组成成分大致与其细胞壁相同，都是由几丁质和葡聚糖等构成而形成紧密的网状结构。利用盐酸对孢子壁中的某些多糖与蛋白质成分作用，破坏网状的共价键，使得原来结构紧密的孢壁变得疏松，再经过沸水浴和骤冷处理，孢壁结构得以破坏，孢内物质溶出，便于提取。胡萝卜素是脂溶性的色素，需用有机溶剂来提取。而它在丙酮中溶解度较大，而丙酮具有低毒、低沸点以及具有较强的挥发性，所以，丙酮是较好的提取剂。破壁及提取的方法： 精确称取0.500g干燥（干燥温度45C）后的发酵基质，于50ml三角瓶中，加入15mL HCL（3mol/L），在常温下避光放置振荡器上振荡1h。沸水浴3-4min，迅速冷却。将破壁好的孢子悬液，转入离心管中，进行离心（5000r/min）10min，弃去上清液，加入适量的蒸馏水搅拌水洗后，再进行离心（5000r/min）10min，弃上清液，重复水洗、离心一次。将完成离心的提取物中加入15ml丙酮，充分搅拌使得-胡萝卜素迅速扩散进入丙酮相中，然后离心（5000r/min）10min，收集上清液，重复操作,直到提取液变为无色为止，合并提取液并记下提取液的总体积。再用紫外可见分光光度计在450nm下测量合并液的吸光值。 5. 测定方法 -胡萝卜素标准曲线的绘制：.标准溶液的配制：精取0.0100g -胡萝卜素标准样品，放入10ml比色管中，用丙酮定容至满刻度。用移液管移取5ml该溶液，转入100ml容量瓶中，然后，用丙酮定容至满刻度，则该溶液中胡萝卜素的浓度即为50g/ml。.标准曲线的绘制：取6支比色管（100.1ml，最小刻度为0.5ml）,依次移取标准溶液0.00ml、1.00ml、3.00ml、5.00ml、7.00ml、9.00ml，摇匀后，用蒸馏水稀释至10ml，此时的溶液分别相当于-胡萝卜素浓度为（g/ml）：0.00、5.00、15.00、25.00、35.00、45.00。然后在450nm下用紫外分光光度计分别测定吸光值，根据数据列表拟合标准曲线。提取得率计算：发酵基质提取得率可由以下公式计算得出。注意事项-胡萝卜素对光、热、氧气、酸不稳定，故在操作过程中，应尽量避开这些不稳定因素。.6. 实验结果与讨论 将不同发酵培养基的基质进行-胡萝卜素测定，实验结果添入下表，比较两种不同发酵培养基中产物的得率。 表1