生物工艺学复习提要.doc

第一讲 概论1、 至今生物技术的发展史上经历了三个浪潮，分别是？医药生物技术，农业生物技术，工业生物技术2、什么是工业生物技术？ 应用自然科学和工程学的原理，依靠生物作用剂将物料进行加工以提供产品或用以为社会服务的技术。3、什么是生物炼制？有什么优势？ 生物炼制是利用农业废弃物、植物基淀粉和木质纤维素材料为原料，生产各种化学品、燃料和生物基材料。生物炼制大幅扩展可再生植物基原材料的应用，使其成为环境可持续发展的化学和能源经济转变的手段。4、工业生物技术重大产品系列包括哪些？生物化学品，生物材料，生物能源第二讲 发酵概论1、发酵的定义？微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢转变成所需产物的过程。2、有氧发酵与厌氧发酵的区别？介绍的产品中哪些是有氧发酵？哪些是厌氧发酵？ 有氧发酵：在有氧环境中进行有氧代谢生成丙酮酸，进入TCA循环，产生有氧代谢产品的发酵过程。厌氧发酵：在无氧环境中进行无氧酵解，丙酮酸继续进行代谢生成无氧代谢产品。3、 发酵过程中菌体生长的阶段？初级代谢产物，次级代谢产物分别在哪个阶段生产四个阶段：适应期，对数生长期，生长稳定期，死亡期初级代谢产物是指微生物在对数生长期通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。次级代谢产物是指微生物在生长稳定期合成的化学结构十分复杂、具有特定功能、与微生物生长和繁殖无明显关系的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。4、 分批发酵、补料分批发酵、连续发酵的特点和优点？ 5、 工业发酵的一般流程是什么？菌种的选育，菌种培养基的配制，扩大培养和接种，发酵过程，分离提纯第三讲 工业微生物1、常用的发酵工业微生物有哪些？原生生物界及非细胞型微生物（病毒、噬菌体），主要是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、噬菌体、藻类等2、 发酵工业对生产菌种的要求？ （了解）产率高原料要易得、价廉发酵条件粗放菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短：感染杂菌的机会减少，提高设备的利用率尽量诱变次数少，避免选择缺陷型菌种纯粹，稳定性好菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。抗杂菌能力强，如抗噬菌体不是病原菌，不产生有害物质和毒素使用新菌种时更应注意：应用食品领域更需经严格鉴定，早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止3、 如何筛选出生产目标产品的菌株？菌株筛选的两个关键问题？（重点）（如何从环境中筛选菌株？）定方案，采样，增殖，分离，发酵性能测定（1）“分离什么和从哪里分离出所需微生物?” 罗列出所要分离的微生物类群根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地土壤是理想的分离环境，不同的产物筛选时需要选取特别的环境，如纤维素酶产生菌、厌氧菌等（2）“如何筛选分离出所需微生物?” 筛选培养基的设计“筛子”有机酸生产菌、纤维素酶生产菌4、 什么是诱变育种？菌种诱变育种的方法？物理诱变，化学诱变，生物诱变物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子,等离子体，超高静压化学因子：如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等（有效，经济，但是致癌）生物诱变：原生质体融合，DNA重组技术6、 什么是菌种保藏？方法有哪些？根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。菌种保藏方法：斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮保藏法第四讲 培养基1、什么是培养基？类型和用途？是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物的所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。按营养物质来源划分：天然培养基，合成培养基，半合成培养基按物理性状划分：固体培养基（适合于菌种和孢子的培养和保存，也用于有子实体的真菌类（香菇、白木耳）的生产），液体培养基（8090%是水，配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基），半固体培养基（在液体培养基中加入0.50.8%的琼脂，用于鉴定细菌、观察细菌运动特征及噬菌体的效价滴度）按用途划分：孢子培养基（是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，营养不太丰富，常用的有麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基、琼脂斜面培养基），种子培养基（是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强壮的“种子”，一般采用营养丰富且完全的培养基），发酵培养基（供菌体生长、繁殖和合成产物之用，组成除有菌体生长所必需的元素和化合物之外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等）2、工业微生物常用培养基？（什么菌用什么培养基）细菌：牛肉膏蛋白胨培养基放线菌：高氏一号培养基酵母菌：麦芽汁培养基霉菌：查氏培养基3、营养源的成份及作用，举例？（鉴别：属于碳源？氮源？）碳源，氮源，无机盐及微量元素，水，生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂碳源：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分 为合成目的产物提供所需的碳成分分为：糖类、油和脂肪（油或脂肪被脂肪酶作用，水解为甘油和脂肪酸，油脂有消泡作用，缺氧会引起有机酸积累，PH下降）、有机酸、烃和醇类氮源：用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物 有机氮源（在微生物分泌的蛋白酶作用下，消解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢 有机氮源营养丰富，还含有少量的维生素和生长因子 花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆（CSL）、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟） 无机氮源，又称快速氮源（铵盐、硝酸盐和氨水等；生理酸性物质与生物碱性物质；(NH4)2SO4、NaNO3）无机盐及微量元素：镁、磷、钠、钾、硫、钙和氯 钴、铜、铁、锰、锌、钼 MgSO4、NaCl 、NaH2PO4、K2HPO4 TMS：trace metal solution水：良好的溶剂，溶解营养物质，细胞的渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介，并且水直接参与代谢作用中的许多反应 水的比热高，是热的良导体，调节细胞的温度 恒定的水源是发酵工厂的关键，水源质量很重要生长因子：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等 有机氮源是生长因子的重要来源 玉米浆中生长因子含量丰富前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高 青霉素：苯乙酸、苯乙胺 （用法：前体普遍采用流加的方法，流加有利于提高前体的转化率。）产物促进剂：产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 4、 发酵培养基选择的基本原则？（理解）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化原料价格低廉，质量稳定，取材容易所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗有利于产品的分离纯化，尽可能减少产生“三废”的物质第五讲 灭菌1、 什么是灭菌？培养过程中那些需要灭菌？灭菌的方法以及使用的范围？（气体用什么方法灭菌？培养基用什么方法灭菌？）所谓灭菌，是指用物理或化学方法杀灭或物料或设备中一切有生命物质的过程培养基灭菌、气体除菌、设备及管道灭菌化学灭菌，射线灭菌，干热灭菌，湿热灭菌（细菌蛋白质在有水的情况下易于凝固变性湿热穿透力强；湿热蒸气有潜热存在，水蒸气凝固成水释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度），过滤除菌，火焰灭菌，物理方法：超高静压分批灭菌，连续灭菌空气的除菌：压缩，冷却，减湿，过滤第六讲 种子培养1、 种子定义？指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 2、 种子质量要求。种子培养与发酵培养的目的与培养基的差异？质量要求：纯；活力旺盛；有足够的菌体浓度差异：要求种子培养至对数生长期中后期3、 接种龄？过于年轻或过老的种子对于发酵的影响？接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况接入种子罐中的种子，随着培养时间的延长，菌丝增加，但由于基质的消耗、代谢产物的积累及菌丝体的死亡，菌丝量不再增加，而逐渐趋于老化。过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶4、 接种量？对发酵的影响？接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例接种量的大小取决于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来接种量大，有利于对基质的利用和产物的合成，生产菌迅速占据培养环境，减少了杂菌生长的机会接种量过多，菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成接种量过小，除了延长发酵周期外，往往还会引起其它不正常情况第七讲 发酵过程控制1、发酵热的来源？（影响生物热的因素）菌体，培养基，发酵时期2、 温度对发酵过程的影响？从动力学角度来看，T升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；另一方面，T升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。 温度通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。影响生物合成方向 如:金色链霉菌35时，合成四环素； 弯叶 箭叶式翻动流体的能力：箭叶式 弯叶 平叶4、 夹套与蛇管在传热能力上的差异？夹套冷却竖式蛇管冷却竖式列管冷却适用范围5m3以下小发酵罐大型发酵罐大型发酵罐气温较高的地区优点结构简单，加工容易，罐内死角少，容易清洗灭菌流速大，传热系数大，降温效果较好。加工方便，提高传热推动力的温差。缺点传热壁较厚，冷却水流速低，降温效果差。冷却水较高时，降温困难，弯曲位置易腐蚀。用水量较大。5、 气升式反应器的形式？气升式反应器与通用式发酵罐的比较与应用？ 气升环流式、塔式、空气喷射式等特点：1）反应溶液分布均匀 2）较高的溶氧速率和溶氧效率 3）剪切力小 4）传热良好 5）结构简单 6）能耗小 7）不易染菌 8）操作和维修方便 应用：酵母生产、单细胞蛋白生产、细胞培养、酶制剂和有机酸等发酵生产、废水生化处理。6、 发酵罐的几何放大计算规则？（1）几何尺寸放大m = V2/V1H1/D1 = H2/D2 = AH2 / H1 = D2 / D1= m1/3（2）空气流量的放大:以Kla=常数的原则进行放大(VVM)2/ (VVM)1 = (D1/D2)2/3 * (P2/P1) （3）采用单位培养液体积通气功率相等的原则P2 = P1 * (d2/d1)2.765 * (g)2/(g)10.24第九章 柠檬酸生产（必考）1、柠檬酸发酵生产的必要条件？ 糖源浓度高：120250g/L磷酸盐浓度低:0.2-1.0g/L氮源用NH4+盐:2.0g/LpH值低:1.6-2.2溶氧量高:金属离子浓度极低: Mn2+10-8M;Fe2+10-4M;Zn2+10-20%7、 碳源、pH、金属离子的控制与机理？碳源的种类和浓度是柠檬酸生产成功的最关键的参数。控制碳源的浓度应在100-150g/L,如果糖的浓度低，海藻糖6-磷酸积累，会抑制己糖激酶；如果糖浓度高，抑制将被抵消。柠檬酸的生产要求低pH：pH3.0以上容易产生草酸，pH5.0容易形成葡糖酸，pH3以下是积累柠檬酸的条件，所以在长菌期完成以后使pH降到3以下是重要的，至少要降到3.5柠檬酸生产应控制金属离子的浓度：锰离子的缺乏会降低HMP途径和三羧酸循环酶的活性，也会导致某些合成代谢的减弱，尤其是细胞内HN4+水平升高，这很可能是蛋白质的合成受干扰，从而导致蛋白质的分解相应增加。高浓度的HN4+是磷酸果糖激酶PFK的一种调节因子，它能解除前述柠檬酸根对PFK的抑制；乌头酸水合酶失活，三羧酸循环阻断是积累柠檬酸的必要条件之一。乌头酸水合酶需要Fe2+，将含量高的原料（如糖蜜）用亚铁氢化钾除铁，可以提高柠檬酸产率。3、为什么要变温培养？黑曲霉属于嗜温微生物，最适生长温度为33-37积累柠檬酸的最适温度多数报道为32产酸期如果仍维持高于32 ，虽然开始柠檬酸生成较快，但长菌也较快，导致菌体量增加，大量的糖被用来生成菌体和呼吸，氧化成CO和水只从柠檬酸产率的角度考虑，产酸期的温度应维持在26 左右，这样可提高产酸率10-20%，但发酵期延长约2-3天4、柠檬酸发酵是典型的好氧发酵过程，过程中对氧要求非常高，是什么原因？黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链，通过侧链呼吸不产生ATP，不会抑制磷酸果糖激酶。在生产中发现，只要通气中断很短时间，会导致侧系呼吸链的不可逆失活，使得黑曲霉只能利用标准呼吸链 ，NADH通过标准呼吸链氧化产生ATP，会抑制磷酸果糖激酶。因此缺氧，甚至是暂时的缺氧即会导致柠檬酸产率的急剧下降，而对菌体生长并无负的影响。因此发酵中必须维持高浓度溶氧。5、 如何筛选利用淀粉质原料的高产柠檬酸菌株。菌样来源：腐烂植物、水果表皮、从含有腐烂未熟水果的酸性土壤中分离。菌种分离： 含菌样品经适当的增殖培养，或将样品浸出稀释液100mL和10薯干粉、10柠檬酸混合。在振荡摇床上于33-35下“富集”培养3-5d然后进行平板划线或者平板稀释分离筛选。从分离筛选平板上，挑出单一菌落，移接于麦芽汁琼脂斜面上，于33培养6-7d孢子长好后，分别接入三角瓶，摇瓶发酵试验(初筛、复筛)，从中筛选出产柠檬酸高、糖转化率高、且产酸稳定性强的菌种，作为生产用菌株。第十章 丁二酸生产1、如何从瘤胃中筛选高产丁二酸的生产菌株瘤胃菌群富集培养（丁二酸二钠、莫能菌素、富马酸二钠）平板初筛（溴百里香酚蓝）复筛菌株A326.5g/L丁二酸、1.6g/L乳酸、3.6g/L甲酸、17.4g/L乙酸（50g/L葡萄糖）2、 增强CO2供给和减少有机酸的抑制作用是丁二酸发酵过程中两个关键的问题。CO2 的供给：含有CO2 的培养环境有利于菌的生长；最佳CO2 供给条件： 减少有机酸的抑制作用：甲酸、乙酸、丁二酸的合成都属于与生长部分相关型。 3、 有机酸生产中厌氧与好氧方式的异同？（丁二酸的生产比较，总结）环境不同（氧化还原电位、pH、溶氧等），动力能耗不同，产物不同，关键是菌种不同。4、 丁二酸的生产过程是典型的厌氧过程，产品收率高。试从厌氧发酵的机理上解释其收率较好氧发酵为高的原理？（总结）好氧发酵消耗大量的氧气排出二氧化碳，厌氧发酵中无二氧化碳的排出，大量的碳进入细胞。好氧发酵中NADH中的H与氧气结合生成水，而厌氧发酵中的NADH中H变成最终产物。厌氧发酵中菌体合成少，大量的碳进入产物。第十一讲 抗生素发酵1、抗生素的定义、合成方法及类型 抗生素：指由细菌、真菌或其他微生物在生长过程中产生具有杀灭和抑制病原体的微生物产物，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。例如青霉素、链霉素、红霉素等。合成方法：生物合成（微生物发酵）；化学全合成；半合成方法a、-内酰胺类(-lactam )：青霉素类、头孢菌素类，包含一个四元内酰胺环b、氨基糖苷类(Aminoglycosides)：链霉素、庆大霉素，既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇c、大环内酯类(Macrolides)：红霉素、麦迪加霉素，含有一个大环内酯作配糖体，以苷键和1-3个分子的糖相连d、四环类(Tetracyclines) ：四环素、土霉素，以四并苯为母核e、多肽类(Peptides) ：多粘菌素、杆菌肽，含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链的环状多肽2、发酵生产过程中温度的控制？pH是如何调节的？温度控制：前期25-26，后期23pH控制：一般为6.4-6.6，加酸加碱以及加葡萄糖控制3、 什么是前体？青霉素的前体是什么，加入的目的，如何加入？前体：菌体利用其构成抗生素分子中的一部分而其本身没有显著改变的物质，一定条件下控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。青霉素的前体：苯乙酸，苯乙酰胺，苯乙酰酯类、醇类等加入目的：