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第十八单元 免疫学检测技术一、血清学技术血清学反应是指在体外进行的抗原抗体结合反应，相关的技术称为血清学技术。(一)沉淀反应 可溶性性抗原和相应特异性抗体以合适的比例结合，在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应。单向免疫扩散、双向免疫扩散、对流免疫电泳、免疫电泳均为沉淀反应。1单向免疫扩散 制备含特异性抗体的琼脂板。在适当的位置打孔，加相应抗原于孔内。抗原自小孔向四周琼脂中扩散，在适当的位置形成环状的沉淀线。环的直径和抗原的浓度呈正相关。此法常用于人或动物血清免疫球蛋白和补体成分的测定。2双向免疫扩散 在琼脂板上按一定距离打孔。在相邻的两孔中分别加入抗原和抗体。抗原和抗体在琼脂中扩散，当二者相对应时，可在两孔间的适当位置形成由免疫复合物组成的沉淀线。此法常被用于抗原或抗体的定性。3对流免疫电泳 将两端各打一排孔的琼脂板置电泳槽中，在阴极一侧的孔中加抗原，阳极一侧孔中加抗体，通电使抗原抗体分子泳动，当二者相对应时，可于一定时间后在两排孔之间形成沉淀线。对流电泳是电场作用下的双向免疫扩散。4免疫电泳 先将待测抗原样品做琼脂糖凝胶电泳，使不同的组分依电泳速度不同而分散开。然后在样品泳道一侧的适当距离处挖一和泳道平行的直线沟槽。于槽内加入已知抗体(一种或多种)。让抗原和抗体进行双向免疫扩散，在泳道和槽的中间形成沉淀线。此法可用于免疫球蛋白缺乏或增多疾病的诊断和鉴别诊断。(二)凝集反应 颗粒性抗原(细菌、红细胞、偶联抗原的乳胶颗粒)与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，此称为凝集反应。1直接凝集 直接凝集是颗粒性抗原(细菌、红细胞)与相应抗体结合产生的凝集反应。利用直接凝集可鉴定细菌和血型。2间接凝集 将可溶性抗原或抗体包被在红细胞或乳胶颗粒载体表面后，与相应抗体或抗原作用出现的凝集。采用红细胞为载体的间接凝集称间接血凝。采用乳胶颗粒为载体的凝集称为乳胶凝集。以包被抗原检测抗体的间接凝集称为正向间接凝集。以包被抗体检测抗原的间接凝集称为反向间接凝集。用此法可检测乙型肝炎表面抗原和甲胎蛋白等。【历年真题解析】1. 血清中常规检查检测不到的HBV标志物是 (2004)A HBsAgB HBeAgC HBcAgD抗-HBeE抗-HBc答案：C解析：目前临床诊断乙型肝炎最常用的是检测HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc，俗称“乙肝两对半”。核心抗原(HBcAg)存在于Dane颗粒核心结构的表面，为内衣壳成分，其外被HBsAg所覆盖，因此在周围血中很难检测到。2. 骨肉瘤病人可出现（2002）A血酸性磷酸酶升高B血碱性磷酸酶升高C血CEA升高D血AFP升高E血VCA-IgA抗体升高答案：B解析：血清学检查中，肝癌、骨肉瘤时血清碱性磷酸酶可升高。3. 体液免疫测定是指（2001）A皮肤迟发型超敏反应B血清谷丙转氨酶测定C血清免疫球蛋白测定D血清-微球蛋白测定E硝基四唑氮兰还原试验答案：C解析：体液免疫测定是检测体液免疫功能的一种方法，主要用于血清免疫球蛋白测定二、免疫标记技术(一)免疫荧光 免疫荧光技术是用荧光素标记的抗体或(抗原)分子检测相对应的抗原或抗体分子的技术。1直接荧光法 把荧光素标记的抗体与待检标本(细胞悬液、细胞涂片或组织切片)相互作用，洗去未结合荧光标记抗体，在荧光显微镜下观察，有荧光的部位为阳性。2间接荧光法 将特异性抗体(一抗)和待检标本(细胞悬液、细胞涂片或组织切片)相互作用后，加入荧光索标记的一抗的抗体(二抗)显示结果。免疫荧光法在病原体的诊断、细胞表面标志的鉴定等方面用途广泛。流式细胞仪(FACS)是用于分离、鉴定荧光素标记单克隆抗体识别细胞的仪器。(二)放射免疫分析 根据竞争结合原理，应用放射性核素标记的抗原与相应的抗体(抗原)结合，通过抗原抗体复合物的放射性活性判断结果称放射免疫分析。该方法最敏感。1液相法 将待检标本(含抗原)与定量的放射性核素标记的已知抗原和定量的特异抗体混合，经一定时间的作用后，分别测定免疫复合物和游离部分的放射性。根据用非标记抗原作成的标准曲线，可确定待检样品中相应抗原的含量。 2固定法将吸附到固相载体表面的抗原与待检标本(含抗体)作用，然后加标记抗体。测定结合于固相载体的放射性，判定结果。 放射免疫分析法在激素、药物、抗体、维生素的测定等方面应用广泛。【历年真题解析】1检测血清中一种微量的小分子肽，下列方法中最敏感的是A.免疫荧光技术B.放射免疫分析法C.双向琼脂扩散法D.单向琼脂扩散法E.对流免疫电泳答案：B解析：放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法，用于定量测定受检标本中的抗原。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法的灵敏度高达ng甚至pg水平，特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。(三)酶免疫分析1免疫酶染色 酶标抗体和抗原(如组织切片上的抗原)发生特异性结合后，加入酶底物。底物在酶的催化下生成有色的物质。2酶联免疫吸附实验(ELISA)(1)间接法：将已知的抗原包被在固相载体的表面，加入待检标本(含特异性抗体)，再加入酶标记抗Ig抗体(第二抗体)。加底物显色，根据颜色的光密度判定标本中抗体的含量。(2)夹心法：将已知的特异性抗体包被在固相载体表面，加入待检标本(含抗原)，标本中的抗原和包被的抗体结合。冲洗后，加入该抗原的酶标抗体，加底物显色。根据颜色的光密度判定标本中抗原的含量。3ELISPOT测定法 用某种细胞因子的抗体包被固相载体(如96孔板)，加入待检细胞，经孵育后，如待检细胞分泌了细胞因子，这些因子被包被的抗体捕获。洗去细胞，加细胞因子特异性抗体。洗去未结合抗体。加酶标抗体，洗去未结合抗体。加底物显色后，可出现有颜色的斑点。根据斑点的数量可判定细胞因子分泌细胞的数量，根据斑点的深浅，也可判定此细胞因子的相对含量。(四)化学发光物质标记技术 用化学发光物质(如鲁米诺)标记的抗原或抗体进行抗体或抗原检测的方法。其结果用发光光度计来检测。(五)免疫印迹试验 将抗原物质用聚丙烯酰胺凝胶电泳分带后转至硝酸纤维素膜上，用酶标或放射性核素标记的抗体识别和结合抗原，加底物显色或做放射自显影显示结果。该法能测定待检蛋白质的分子量和特异性。应用该法检测血清中的HIV抗体是确认HIV感染的方法。三、淋巴细胞的分离和检测技术 (一)外周血单个核细胞的分离 聚糖-泛影葡胺(又称淋巴细胞分离液)密度梯度离心法是分离制备外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的常用方法。将抗凝血叠加于分离液上，通过低速离心，即可将不同比重的细胞分层：红细胞沉于管底；中性粒细胞密集布于红细胞层与分离液之间；血小板悬浮于血浆中；PBMC则密集于血浆层与分离液界面。PBMC含淋巴细胞和单核细胞。利用单核细胞粘附塑料的特性，可将其从PBMC中移去。(二)流式细胞法 流式细胞法(flow cytometry，FCM)是用荧光活化细胞分类仪(fluorescence-actirated cell sorter，FACS)对细胞进行分类的方法。用荧光素标记的抗体识别和结合待分离的细胞。根据细胞标记荧光素的有无和种类，采用FACS可分离各种免疫细胞。采用流式细胞法，也可利用细胞的表面标志对各种免疫细胞进行鉴定。【历年真题解析】1要从混合的T、B细胞中分离T细胞，最佳的方法是 A.流式细胞技术B.放射免疫分析法C.ELISAD.双向琼脂扩散试验E.免疫电泳答案：A解析：流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：测量速度快；可进行多参数测量，并具有明显的统计学意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。能精确的从混合的T、B细胞中分离T细胞。(三)磁珠分离法 磁珠分离法是利用免疫磁珠进行分离细胞的方法。免疫磁珠(immune magnetic bead，IMB)是特异性抗体与磁性微粒的交联物。IMB可通过磁珠上的特异性抗体识别并结合表达相应膜抗原的细胞。应用磁场，可分离结合IMB的细胞。如采用抗CD3特异性抗体IMB可分离T淋巴细胞。(四)T细胞的功能测定技术1T淋巴细胞转化试验 在体外培养的条件下，人T淋巴细胞受特异性抗原(如结核菌素)或非特异性有丝分裂原如植物血凝素(PHA)的刺激后可发生增生，转化为淋巴母细胞。以3H-胸腺嘧啶参入试验可测定淋巴细胞发生转化的程度。细胞免疫功能低下的人，T淋巴细胞转化率降低。刀豆蛋白A(ConA)是小鼠T细胞的非特异性有丝分裂原。2混合淋巴细胞培养器官移植前应取受体与供体的淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养试验以挑选合适的供体。混合淋巴细胞培养分双向法和单向法。(1)双向法：将两个个体的淋巴细胞混合在一起培养，若二者的HLA分子不同，两个来源的淋巴细胞都会受到刺激而发生转化。根据转化的程度可判定两个个体淋巴细胞HLA分子的相异的程度。单卵双生子间的淋巴细胞混合培养后不发生转化。(2)单向法：将一个个体的淋巴细胞用丝裂霉素或放射处理使之失去自身的转化能力，但保留着抗原性。用这种淋巴细胞和未经处理的另一个个体的淋巴细胞混合培养。根据未经处理的淋巴细胞的转化程度来判定两个个体淋巴细胞HLA分子的相差的程度。混合淋巴细胞培养实验中，T淋巴细胞和B淋巴细胞均可发生转化。3迟发超敏反应皮试 将已知量的抗原(如结核菌纯化蛋白衍生物)注射入前臂皮内，2448小时后测定硬结大小，硬结直径大于lOmm即被视为阳性。皮试阴性的人，可能有细胞免疫功能低下也可能未接触过相应的抗原。4细胞介导的细胞毒试验 用效应性CTL和51Cr标记的靶细胞相互作用。被杀伤的靶细胞可释放51Cr。测定靶细胞释放的51Cr产生的放射性，就可判定效应细胞效应性CTL的细胞毒活性。用类似的方法也可测定NK细胞的细胞毒活性。(五)B淋巴细胞功能的检测1B淋巴细胞转化试验将人淋巴细胞和不溶性的金黄葡萄球菌(B淋巴细胞分裂原)一起培养，以3H-胸腺嘧啶参入试验可测定发生B淋巴细胞发生转化的程度。细菌脂多糖是小鼠的B细胞分裂原。2抗体生成细胞的测定 常用溶血空斑试验(hemolytic plaque assay)。在此实验中，抗体生成细胞分泌的Ig与绵羊红细胞(SRBC)表面的抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。方法是将吸附有已知抗原的SRBC、待检的B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾注平皿，温育l3小时后，肉眼可见分散的溶血空斑，每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数。四、细胞因子的检测技术(一)生物活性检测 多种细胞因子(如IL-2、IL-6)在体外试验中可刺激其依赖株细胞增生。以3H-胸腺嘧啶核苷参入法做细胞增生试验就可判定这些细胞因子的生物学活性。利用某些细胞因子的功能特点也可检测