植物功能基因组学研究的主要方法和技术.doc

植物功能基因组学研究的主要方法和技术 基因组破解以后，功能基因组的主要任务就是要明确基因的表达调控方式，鉴定基因的功能，弄清楚基因所在的调控网络（Orphanides and Reinberg, 2002）。基因组研究转入后基因组学时代，并由正向遗传学研究转到以反向遗传学为主的研究路线。为加快功能基因组学的发展，科学家们发明了很多高效快速的研究方法和技术。这些技术包括：1基因表达谱分析技术，如高通量基因芯片、高通量原位杂交技术等；2以T-DNA或转座子介导的基因标签（gene tagging）技术；3功能缺失技术，如基因打靶技术，反义RNA，核酶（catalytic RNAs，ribozymes），RNA干扰（RNA interference，RNAi），显性负突变等技术；4基因功能增强技术，如基因超量表达，诱导表达及基因异位表达技术。1 基因表达谱分析技术基因的表达与基因的功能紧密相关。许多时空特异表达或受环境诱导表达的基因参与植物生长发育，生理代谢，逆境反应等各个不同过程。故研究基因的时空表达特性是推测基因功能非常重要的依据。基因芯片技术成为基因表达谱分析技术中越来越常用的技术之一，主要是因为它具有高通量特点，即能够同时研究成千上万的基因表达分析。随着基因芯片制作成本的降低，实验设计和分析软件的日趋完善，基因芯片产生的数据质量也越来越高，应用也越来越广，在植物、动物的各个研究领域都有广泛的应用。随着基因组序列的完成，基于基因组序列设计的全基因组芯片用于科学研究成为首选。例如，Bertone等人（2004）利用覆盖人类全基因组（用约5千多万36-mer345678910 . >>长的寡核苷酸探针代表人类全基因组）的“盖瓦芯片”（tiling array，又称嵌合芯片）研究肝脏中所有可能的转录序列，找到了一万多个新的转录序列，而且超过一半的新序列并非位于预测的基因内部而是位于预测的基因间。拟南芥的精细序列图谱的完成使得人们在拟南芥中开展全基因组嵌合芯片分析成为可能。2003年，Yamada等人利用25-mer的寡核苷酸探针对拟南芥四种不同细胞系进行了转录活性研究，鉴定了五千多个转录单元，并检测到了大量的反义链基因表达。2005年，Stolc等人改进嵌合芯片合成技术之后，采用覆盖拟南芥全基因组的五百万个36-mer寡核苷酸探针检测拟南芥T87细胞悬浮系的基因表达谱，发现该细胞系表达了拟南芥中预测基因的60，还新发现了Yamada等人2003年的实验中未找到的151个基因，同样地，也发现了许多反义链基因表达。随着水稻粳亚种籼亚种基因组精细序列的释放（IRGSP, 2005; Yu et al., 2005），水稻全基因组嵌合芯片也已开始制作，目前主要集中在已知精细序列的第4，10号染色体上，如Jiao等人（2005）利用4号染色体的双链DNA嵌合芯片检测六种不同器官的基因表达，结果显示82的预测基因是表达的，还发现了另外没有基因注释的1643个转录活性区。Li等人（2005b）利用籼稻和粳稻的第10染色体寡核苷酸嵌合芯片（分别用84上一页345678910 . >>万和75万个36-mer的寡核苷酸探针覆盖两个籼粳稻亚种）检测幼苗的根，叶，稻穗和悬浮细胞系的基因表达情况。他们发现大约预测基因的3/4是有转录活性的，还在粳稻染色体上找到了以前没有预测的549个新的转录单元，并且发现该染色体上19.6%（591个基因）的预测基因表达反义链基因。而最近，他们又制作了籼稻93-11的全基因组嵌合芯片，该嵌合芯片由覆盖全基因组非重复序列的一千三百万个36-mer寡核苷酸探针组成，同样地，利用该芯片检测上述细胞或组织的基因表达，发现81.9%的预测基因（共43,914个非冗余基因）中约36,000个基因处于表达状态，并发现五千多个基因间区域也是转录活性区域，另外还发现一万多个基因（占23.8%）有反义链表达（Li et al., 2005a）。这些全基因组芯片数据大大丰富了人们对转录组的认识，为我们理解整个基因组的结构和功能提供了前所未有的强有力工具，并为全面揭示基因组的表达，转录组的表达与表型之间的相互关系提供了坚实的平台。虽然基因芯片能一次提供很多基因的表达信息，但对于多细胞生物而言，由于细胞分裂分化导致不同的细胞类型产生，那么这些表达的基因到底如何与复杂的组织或器官中不同细胞类型相对应却是基因芯片所无法完成的。人们把自动化技术和组织切片学技术结合起来产生了高通量原位杂交技术，该技术能一次获取大量基因在细胞水平上的表达信息。在医学上，由于该技术具有快速、平行、高通量分析病理组织切片提供的生物信息等特点，故又被称为组织芯片或组织微阵列（tissue microarrray）（Kononen et al., 1998）。在果蝇及其他物种上，高通量原位杂交技术已用于大量基因的细胞水平鉴定（Kononen et al., 1998; Tomancak et al., 2002; Imai et al., 2004）。2005年，Drea等人首先在植物中中引入该技术用于分析小麦颖果发育过程中的相关基因。他们首先利用基因芯片技术找到颖果发育过程中基因表达有所变化的888个基因，并制作成原位杂交探针，分别与开花后3天、6天、9天的组织切片进行杂交，结果表明有665个基因在一个或多个发育阶段表达，有上一页345678910 . >>223个没有检测到表达。在这665个基因中，有65个基因参与了细胞周期调控（由于在空间上产生了非连续的斑点表达模式），如大部分的组蛋白家族成员，mcm类基因，新的微管相关蛋白，及E3泛素连接酶等；有118个基因表现出在某单一细胞类型高度表达的模式，有89个基因表现出单一细胞类型特异表达模式。相信随着技术的进步，基因芯片与组织切片学技术相结合的组织芯片技术能准确精细地提供大量基因的时空间表达模式，为高通量地研究基因功能提供了强有力的技术支持，在植物中将有更广阔的的应用前景。2 以转座子或T-DNA介导的基因标签（gene tagging）技术要获得基因组中未知功能的基因或DNA片断的生物学功能，那么就要对这些未知功能区进行体内改变，看DNA改变后的生物体有什么功能上的缺陷，从而推断基因的功能。例如，通过物理方法，如射线（gamma ray），或化学试剂如甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）等处理植物种子造成基因组片断的缺失或碱基替换，形成突变体，然后分离导致突变的基因，即可鉴定基因的功能。然而这一过程上一页345678910 . >>却相当复杂，而且受到基因组大小的限制。解决这一问题的一个办法就是利用转座子的分子特性或农杆菌介导的T-DNA随机插入基因组特性对基因组区域打上烙印，然后根据转座子或T-DNA的已知序列分离插入位点两翼的基因组序列，从而实现快速分离基因的目的。自Fedoroff首次（1984）利用转座子标签技术在玉米中分离到功能基因后，在植物中利用转座子标签法克隆基因已有诸多报道。采用转座子标签技术的一个显著优点就是能够产生回复突变，据此可以确认突变表型是由转座子引起的。另一优点就是转座子可以不断跳跃产生新的突变，这样相对较少的转化株系就可以获得基因组的饱和突变，大大减少工作量。利用这一优点，还可以应用于转化效率不高的植物，只要产生少量的转化株，就可以通过转座获得更多新的突变体株系。由于许多物种自身的转座子研究不够深入，利用已知的异源转座子如Ac/Ds、En/Spm转座子应用于拟南芥、番茄、烟草等双子叶植物功能基因组研究已取得成功（Hehl and Baker, 1989; Aarts et al., 1993; van der Biezen et al., 1996），同样，异源转座子也成功地应用于水稻功能基因研究（Izawa et al., 1997）。Ac/Ds是植物中常用的异源双元转座系统。Ac元件能编码转座酶，可以自行转座，称为自主转座元件；Ds则是Ac的缺失体，完全或部分缺失了编码转座酶的基因，不能产生转座酶，但仍保留有两侧的反向重复序列，可以在Ac编码的转座酶帮助下发生转座，因而称为非自主转座元件。人们为了更好控制转座，通常将Ac改造成不能转座的元件，如sAC（stable Ac），能合成转座酶，但缺少转座必须的未端反向重复序列。为了方便地检测Ds是否已经从原位置转座，可以将Ds克隆到一个标记基因的启动子和起始密码子之间，这样可以通过筛选标记基因的表达来检测Ds是否已经转座。把构建好的sAc、Ds放入T-DNA上一页345678910 . >>载体上，分别通过农杆菌介导的遗传转化的办法获得两种株系，再经过这两种株系的遗传杂交使子代植株中既含有合成转座酶的Ac，又含有转座成分Ds，Ds在Ac的作用下即可发生转座，并引起基因突变，从而产生表型突变株。在水稻中，转座子标签技术已有大量应用，并产生了相当数量的突变株系，为水稻的功能基因组研究提供了可贵资源（Enoki et al., 1999; Upadhyaya et al., 2002; Greco et al., 2003; Kumar et al., 2005）。T-DNA，即转移DNA（Transferred DNA），在农杆菌协助下可以稳定地整合到植物基因组的外源DNA序列，因而序列已知的T-DNA可以用作植物基因标签。T-DNA整合到基因组的整个过程已基本弄清（Tinland, 1996; Valentine, 2003），农杆菌介导的T-DNA标签技术已在植物中取得广泛的应用。双子叶模式植物拟南芥中已建立了许多大型的T-DNA插入突变体库，而且许多“标签”的侧翼序列已经通过鉴定，如SALK研究所产生的大型突变体库及侧翼序列（Alonso et al., 2003），以及SAIL（Syngenta Arabidopsis Insertion Library）实验室的突变体库等（Sessions et al., 2002）。这些突变体的产生极大地推动了拟南芥的功能基因组研究，为克隆并鉴定基因及其他调节类因子的功能提供了遗传资源。不过要“标签”上一页345678910 . >>许多小的基因，如MicroRNA，CLV3（CLAVATA3，92个氨基酸残基组成）等，则需要更多的T-DNA插入系产生（Krysan et al., 1999）。自从Hiei等人（1994）在水稻中建立了高效的T-DNA遗传体系后，水稻中的T-DNA标签库也在不断的增多（Jeon et al., 2000a; Jeong et al., 2002; Chen et al., 2003; Wu et al., 2003），这将大大加速水稻这一重要粮食作物的功能基因分离和鉴定，如雄花育性相关基因Utd1（Undeveloped Tapetum1）的克隆（Jung et al., 2005），花发育相关基因OsMADS3的功能精细确定（Yamaguchi et al., 2005）等均是建立在T-DNA插入突变体基础之上的。要产生水稻基因组的饱和突变体库，其工作量之大非某个单一的实验室所能完成的，所以，最近，有人提议收集世界范围内的所有水稻突变体标签库，并建立一种可持续的机制让所有水稻研究者们能分享感兴趣的突变体及相关研究工具（Hirochika et al., 2004），相信全世界范围的合作关系一旦建成将会极大地推进水稻功能基因组研究进程。简单的标签技术，无论是转座子标签还是T-DNA标签对鉴定基因的功能有其局限性，主要表现为没有突变表型，原因是：1许多基因存在功能冗余基因，可以补偿突变基因的功能，如拟南芥中的SHATTERPROOF上一页345678910 . >>（SHP）基因，只有当SHP1和SHP2同时突变后，才表现出种子不脱粒的表型（Liljegren et al., 2000）；2突变体筛选条件不当，如ATK1钾离子通道蛋白突变体，只有在钾离子浓度较低时才表现出突变表型（Hirsch et al., 1998）。3一些重要基因突变后，会导致早期胚胎发生致死或是配子体发育致死效应，因而不能进行纯合突变体分析，很难鉴定这类基因的功能。为了克服这些缺陷，人们对转座子或T-DNA插入载体进行修饰，发展出各种新的载体系统，如激活标签（activation tagging），基因诱捕（gene trap），启动子诱捕（promoter trap），增强子诱捕（enhancer trap）等载体系统，这些载体不仅可以用于产生功能丧失（loss-of-function）突变体，还能产生功能获得性（gain-of-function）突变体，也还可以通过鉴定报告基因的表达模式以分离特异启动子或增强子，以及异启动子或增强子控制的特定基因。(1) 激活标签（activation tagging）激活标签就是通过在T-DNA或转座子的边界区加上CaMV 35S这样的组成型启动子或是加上由四个CaMV 35S上一页345678910 . >>中的增强子元件聚合成的增强子来驱动植物内源基因的超量表达从而产生显性突变的基因标签（Wilson et al., 1996; Weigel et al., 2000）。一旦这样的标签插入到一个基因附近（基因前，或基因后，或基因间），那么标签上所携带的增强子将会在任意方向上并且能够长距离地激活基因的表达，产生新的功能获得性表型。实际上也确实如此，比如拟南芥的yucca功能获得性突变体就是由于带增强子的T-DNA标签插入到YUCCA基因的下游3 kb处激活该基因的结果（Zhao et al., 2001）。自Walden等人（1994）首先在植物中建立该系统并获得各种表型显性突变体以来，人们已经利用它克隆了为数不少的基因。这些基因涉及拟南芥形态发育，开花时期调控，生理生化代谢途径，激素反应，信号转导，抗病抗逆防卫反应等诸多生物学过程。2002年，Jeong等人最早在水稻中建立了约13,000株的T-DNA（含激活因子）插入系，到2005年底已有50,000个独立转化株系（Hirochika et al., 2004; Jeong et al., 2006），他们发现约一半的靠近增强子内源基因的表达活性被增强，这些表达上升的基因大部分还是在原有表达基础上有所增强，而并没有被改变表达部位（Jeong et al., 2006）。不过，目前在水稻中还没有报道到底有多少显性突变体是由内源基因被激活标签引起的，而在拟南芥中也仅仅0.1%（Weigel et al., 2000）到1%（Marsch-Martinez et al., 2002）的显性突变是由激活标签引起的。上一页345678910 . >>(2 )启动子或增强子诱捕技术（gene trapping）基因组中除了基因行使重要功能外，另一个具有同等重要性的遗传因子就是控制基因表达的顺式调节元件。Carroll（2000）认为基因的顺式调节系统的改变往往是比基因的数目或蛋白质功能的改变更能构成表型多样化的原因，并指出不管动物的外表多么不同，都具有相近的遗传“工具箱”（toolkit），如转录因子和信号转导途径等，而何时使用怎么使用这些“工具”是各个物种的顺式调节因子所负责的。所以，顺式调节因子也是功能基因组学中非常有必要深入研究的一个领域。为了原位地探测这些特异顺式调节因子