mu转座子介导的株高突变优势筛选.doc

河北农业大学 本科毕业论文(设计)题 目： Mu转座子介导的株高突变优势筛选 学 院： 农学院 专业班级： 植物科学与技术0802 学 号： 2008014040202 学生姓名： 田鹏浩 指导教师姓名： 陶勇生 指导教师职称： 副教授 二O一二 年 6月 6日Mu转座子介导的株高突变优势筛选田鹏浩 (河北农业大学，保定 071000)摘要：【目的】Mutator（Mu）转座子是玉米基因组内产生诱变的内源转座因子，其在基因组内的拷贝数和诱变效率远远优于其它转座子。利用Mu转座子介导的玉米株高性状的突变体来研究其遗传特性。通过计算后代株高的分离情况，来验证株高的突变是否与插入有关，以及扩增Mu因子插入位点的侧翼序列，为找到影响株高的基因奠定基础，从而扩展株高突变的分子遗传学研究。此外，还为高产玉米育种提供了种质资源和理论指导。【方法】使用原始Mu群体（uniformMu）与玉米优良自交系综31杂交获得M1代，对其自交后代的M5群体的植株表型进行逐株全生育期的田间调查，根据极端性状的遗传分析和数量性状的统计分析筛选和鉴定Mu转座因子插入诱变的突变群体。【结果】研究结果表明，筛选了M5群体的的75个家系共543株，11BD753、613、728、1748、1779家系出现株高性状的分离，极有可能是Mu插入引起的，其中，11BD753、1779为矮化突变，11BD613、728、1748为高杆突变。【结论】目前经过分析的这几个家系的胚大小性状出现了显著分离，需要进一步对其研究，尤其是要找出Mu插入位点的侧翼序列，再经行基因功能和遗传方面的研究。关键词：玉米 ；Mutator转座子；株高突变；突变分析Screening Mutatormediated Plant Height mutation advantageAbstract: 【Objective】Mutator (Mu) transposons is endogenous transposons producing mutation groups, in maize genomic .Its copies and mutation frequency are superior to other transposons. By Mutatormediated maize plant height to study their genetic characteristics. By calculating the separation of mutation plant height, to verify whether the plant height is related with the insertion of Mutator, and find Mutator flanking sequences, then to lay foundations for finding genes that affect the height of the plant. Moreover, to extend the molecular genetic studies of plant height mutation development, in addition ,to provide germplasm resources and theoretical guidance for breeding high yeild maize. 【Method】Using uniformMu and elite inbred line Z31 crossing got M1 and to its Self-crossed Progeny M4 do the field survey of the plant phenotype during the whole growth stage, and screening and identifying Mutator mediated inspectional mutations basis on genetic analysis of the extreme characters and statistical analysis of the quantitative characters. 【Result】The study results show that the plant height mutation, from M5 groups 75 families, total over 543 plant ,11BD753,613,728,1748,1779 family lines appear separation of plant height, most likely caused by Mu insertion, and 11BD753,1779 family lines appear dwarf mutation,11BD613,728,1748 family lines appear high pole mutation.【Conclusion】At present there are remarkable separation of this lines after the analysis the character of these maize embryo size, needing more further research on this lines, particularly needing discover the flanking sequence of the Mu insertion and develop aspect research on gene function and the heredity character . Key words: Maize mays L.; Mu transposons; Plant height mutation; Analysis of mutation1.前言 玉米是当今世界最重要的粮食、饲料、和工业原料作物，是全世界最广泛种植的农作物。株高是水稻株型建成重要的农艺性状之一，直接影响水稻品种的丰产潜力和抗倒性能。为实现玉米高产，育种家把创制耐密型玉米新品种作为主要的育种方向，强调株型育种是提高群体光能利用及协调群体与个体之间矛盾的重要性。玉米B73基因组约85%由转座子组成的，其中含量较多、结构最复杂的是Mutator（Mu）转座子家族1。由于转座子结构和遗传的特点，转座子研究已成为功能基因组研究的重要领域，同时也为创制育种材料提供快速简捷的途径。1948年美遗传学家Mcclintock在对玉米糊粉层花斑不稳定遗传现象的研究过程中，提出DNA转座现象，提出“跳跃基因”的概念，即转座子(transposable elements或transposons) 2。之后，1978年Iowa州立大学的Robertson 3博士首次报道了玉米Mutator转座因子 ,随后他对Mu因子进行了大量而细致的遗传研究,研究表明Mutator作为转座子标签进行植物基因克隆优于其他类型的转座子,于是，掀起了利用玉米Mu转座子创造突变体研究热潮。我国在引进国际先进农业科学技术计划（948计划）资助下，正着手利用Mu转座子构建玉米插入突变体库，进而开展一些玉米功能基因组学的研究。Bennetzen根据Mu内部序列的特异性将Mu插入片段分为6个亚族，即Mul /Mu2，Mu3，Mu4，Mu6/Mu7，Mu8和MuDR/Mu5。为了纪念Donald Robertson特别将以前分别命名为MuA2 、MuR21、 Mu9和Cy的自主性Mu因子统一重新命名为MuDR4。在有Mutator活性的玉米品系中，Mutator拷贝数很高（10-100拷贝/基因组）；Mutator造成的体细胞突变极不稳定并可以产生回复突变；Mutator材料与玉米自交系的杂后代中90%仍具有较高的突变频率5-6, 所有Mu插入片段都具有约220bp的末端反向重复（Terminal Inverted Repeat, TIR），在插入位点处往往产生9bp的靶DNA侧翼序列，但每个Mu插入片段的内部序列差异很大。可以说Mu 因子是目前为止发现的转座活性最高、诱变能力最强的植物转座因子, Mu 因子插入突变已成为诱导玉米产生基因突变和分离、克隆玉米基因的主要方法7。另外，Mu 因子有相对保守的末端反向重复，可以用于设计PCR引物8，提高检测插入突变群体的效率，因此，Mu 因子非常适合用于构建玉米突变体库和分离突变体。本实验以具有高转座活性的Mu转座子材料W22：Mu为供体，以我国优良玉米自交系综31为受体，杂交获得大型插入突变群体；采用田间突变型鉴定、室内籽粒性状考察等方法，筛选突变体；利用优化的Mu-TAIL-PCR技术扩增、克隆、测序、生物信息学分析靶位点侧翼序列，分析玉米Mu介导的白化突变体的插入位点并解析叶绿素合成代谢途径中的相关基因，以期初步了解插入位点所参与的玉米Chl合成代谢途径。本研究旨在构建玉米Mu转座子介导的插入突变体库，并初步阐明玉米叶绿素代谢过程的遗传控制。2.材料和方法2.1材料原始群体来源:以引进含有活性Mu转座子具有插入位点bz1-mum9的W22回交群体(uniformMu)原始群体（美国福罗里达大学）为供体材料（父本）, 供试材料：父本W22与优良玉米自交系Z31为受体杂交, 获得插入诱变F1群体（M1）。表型筛选材料：筛选M5中共75个家系，543个单株为观察对象，对其进行统计分析。2.2 方法本实验在河北农大育种中心试验田里进行，五月二十号种植，出苗后调查出苗率及出苗情况。挂牌，田间管理。用皮尺测量各家系株高、穗位；用长直尺测量穗位叶长、叶宽（取最长和最宽处）；用测角仪测量叶夹角，并记录各家系生长特性和观察有无突变性状。取叶片尖端少许（长为5厘米左右）放入塑料袋，对应编号放入冰盒。实验室提取DNA，用TAIL-PCR方法获得含有Mu插入位点的侧翼序列。按照自交和杂交计划进行授粉留种。按照考察要求，测量实验植株的株高，穗位高。调查标准参照崔野韩、张世煌、彭泽斌等编写的植物新品种特异性、一致稳定性测试指南玉米47，于玉米成熟期选取每行中间10个单株考察株高和穗位高，见表1表格 1 株高、穗位高 调查时期和标准性状调查时期调查标准株高穗位高中度乳熟期中度乳熟期从地面到雄穗顶端的高度从地面到第一穗着生节的高度用Excel绘制突变家系与亲本对比直方图，看其分布情况。再用SPSS软件分析，看各家系间以及与亲本的显著性差异，推测其家系是否有性状分离。根据TAIL-PCR测出的侧翼序列来推测其是否与株高性状相关，再基因文库里比对侧翼序列看其是否有同源或已验证了功能的基因，进而研究其功能和遗传效应。3.结果与分析3.1 植株低矮的突变分析 M5群体以亲本的株高（表2）为对照，共有2个家系有极端的矮株，共11个突变株。突变频率为2.026%.现对其矮化的2个家系进行数量统计遗传学方法进行变异分析。每个家系测其中的5株极端低矮植株的株高，计算每个家系的变异系数CV=方差s/平均值。株高及变异系数如表3所示表格 2 亲本的株高及平均值亲本Z31MuDR亲本的株高（cm）亲本株高的平均（cm）183.45192.8679202.2857表格 3 矮化家系的株高分析家系家系平均株高(cm)SD方差变异系数CV11BD75311BD1779117.333397.60007.499636.0959018.3702713.630850.1565647660.139660321用EXCEL对矮化家系和亲本进行多重比较，差异显著性比较，来检验矮化家系的突变与亲本的差异是否显著（表4，表5）表格 4 亲本与突变家系数据分析表格 4 亲本与突变家系数据分析dfkr0.05Rkr0.01Rk122343.083.233.3347.0419966249.3330029550.860340514.324.554.6865.9809822869.4938586571.47939747表格 5 差异显著性分析1234MUZ3111BD75311BD1779202.2857183.45117.333333397.64321104.685714285714*84.9523809523809*18.83571429285.85*66.1166666666667*319.733333331-4R(4,0.01)差异极显著1-3R(3,0.01)差异极显著两亲本1-2R(3,0.01)差异极显著2-3R(2,0.05)差异显著2-3R(2,0.01)差异不显著两突变体3-4R(5,0.01)差异显著1-4R(4,0.05)差异不显著1-3R(3,0.05)差异不显著1-2R(2,0.05)差异不显著两亲本2-5R(5,0.05)差异不显著2-4R(4,0.05)差异不显著2-3R(3,0.05)差异不显著3-5R(5,0.05)差异不显著3-4R(4,0.05)差异不显著4-5R(5,0.05)差异不显著高大株系与亲本的频率，误差分布图通过SPSS软件进行多重比较得到的记过如下（表10）家系N显著水平0.05显著水平0.01Z3111BD728MU11BD174811BD61355555aaaaaAAAAA通过EXCEL做出的结果可以获知11BD613和Z31差异显著，其他突变体间，突变体与亲本间，亲本之间差异不显著，而SPSS软件进行多重比较所得的结论是各家系间差异均不显著，这说明这些突变体家系还不稳定，需作进一步调查和分析。4 讨论4.1 玉米突变体库的现状及利用玉米作为重要的粮食作物和遗传学研究的重要模式植物，其大型突变体库的构建已有数年之久，目前全球创建玉米Mu突变体库已经大规模的启动了。自1995年美国先锋种业公司构建第一个活性Mu因子诱变超级群体，获得和鉴别出大量Mu插入突变体9。2003年May等10建立了玉米定向诱变数据库（Maize Targeted Mutagenesis database, MTMdB），数据库中包括了40 00余种的Mu因子插入突变体，Mu因子的插入位点侧翼序列得分析进行了改进，有效提高了Mu插入突变体筛选效率。Fernandes等11人将活性Mu因子与载体联结构建了基因工程化的RescueMu，将其成功导入玉米品系，获得了大量突变体，并建立了RescueMu序列数据库。McCarty等12利用Mu因子的原始群体（uniformMu），筛选出2 000 多个籽粒性状突变体，建立了籽粒性状的Mu侧翼序列的公共数据库。 至今已应用Mu因子标签法成功地分离并克隆了与玉米生长发育、淀粉合成、氨基酸含量、雄花育性、光合作用、信号传导、细胞凋亡等相关基因40多个。在国内，由本试验室共同参与完成的大型Mu突变库正在进行，目前已取得突破性进展13。关于玉米突变体库的利用，目前一般有两种方法，一种是反向遗传学法，是一个从基因到表型到基因功能的过程，主要涉及到比较基因组学、转录组学、代谢组学以及蛋白组学等领域；另一种是正向遗传学法，是表型到基因功能的过程，有一定条件要求的。包括种植条件、生物或非生物条件胁迫、特定组织的报告基因的表达检测条件等等。相对于反向遗传学法，正向遗传学法的优势在于不受基因功能注视的限制，分子检测容易，从而利于研究基因的功能和找到编码假定蛋白的基因。4.2 Mu 转座子介导的玉米突变类型 属于玉米内源转座子的Mu转座因子的转座活性高，因而以Mu转座子介导构建突变体库具可操作性、现实性和有效性。本研究使用的原始MuDR群体(uniformMu)与综31杂交杂交, 对其M5表型进行筛选和鉴定，通过对株高性状的筛选和分析，知道突变家系植株的突变率是2.8545%。Mu转座因子有多种亚族，根据Mu 内部序列的特异性将Mu插入片段分为6 个亚族,(Mu1/Mu2、Mu3、Mu4、Mu6/Mu7、Mu8、MuDR/Mu5。刘文婷等使用Mu7与不同的自交系进行杂交,，对其M2群体进行了筛选表明，Mu7的诱变受遗传背景的影响较大)， 说明Mu转座子的转座活性受其自身的结构影响14。本研究对M5诱变群体的遗传分析和统计分析表明，MuDR转座因子的插入产生诱变的突变类型多样，诱导株高矮化的突变与亲本差异显著，突变稳定。通过生物信息学分析，MuDR转座因子的插入可覆盖全基因组，使用分子生物学方法对侧翼序列的分离和克隆将验证这个结果的正确性。4.3 Mu转座子介导表型筛选的建议研究中对M5表型进行筛选和鉴定，获得突变体，构建突变库。研究关键是筛选的突变是否能真实遗传，同时也是本研究的重点。在M5分离群体中进行突变性状的筛选和鉴定，须对控制性状的分子遗传及其机制进行了解，根据性状的差异，应采用遗传分析方法、或其与统计分析方法相结合筛选和鉴定突变性状。本研究采用的方法的验证工作在进行中。1 Schnable PS, Ware D, Fulton RS, et al. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics J. Science, 2009, 326(5956):1112-5.2. McClintock B. Mutable loci in maize. Carnegie Inst Wash YearBook, 1948, 47: 1551693. 高友军, 刘文婷, 陶勇生等. 玉米Mu转座因子及其应用. 作物学报, 2006, 32(18): 1236-1243.4 Bennetzen J, Springer P, Cresse A, et al. Specificity and regulation of the Mutator transposable element system in maizeJ. Critical Reviews in Plant Sciences, 1993, 12(1): 57-95.5 Chandler V,Hardeman K. THE Mu ELEMENTS OF Zea maysJ. Advances in genetics, 1992: 77-122.6 de la Luz Gutierrez-Nava M, Warren C, Leon P, et al. Transcriptionally Active MuDR, the regulatory element of the Mutator transposable element family of Zea mays, is present in some accessions of the Mexican land race Zapalote chicoJ. Genetics, 1998, 149(1): 329-346.7. May B P, Liu H, Vollbrecht E, et al. Maize-targeted mutagenesis:A knockout resource for maize. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 1154111546