邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量.doc

邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量一、实验原理:邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。二、实验试剂：这个液体貌似是不能研磨的，而且本身就是酶，正常的生物体内的酶不都是可溶的？研磨是为了破碎细胞的。我觉得应该是通过加水打碎胶体，把抗氧化剂全都搞到水中（这个拜托查下）分液乙醇-氯仿沉淀（用来鉴别是带Mn还是CuZn）（不知道会不会有另外两种抗氧化剂干扰）透析（去离子电泳用）乙醇-氯仿的浓度比酶的保存问题：测一下大宝pH应该可以作为参考，但是这个酶种类太多了，要点就是pH至少不能小于6，关于最适合pH是否也要测量？还是说我们是为了测量大宝里面SOD的活性所以就按照大宝的pH保存。还有一个小小的想法就是。这部分是1次做完还是两次做完？大宝sod蜜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根成分：水，矿油（保湿），甘油（保湿），鲸蜡硬脂醇（稠化剂），聚二甲基硅氧烷（硅油），油，无视。月桂醇磷酸酯钾降低pH变成油，超氧岐化酶（SOD，抗氧化剂），人参根提取物（抗氧化剂），膜荚黄芪根提取物（抗氧化），甘油硬脂酸酯（稠化剂）油，EDTA二钠（螯合剂）干扰剂，香精，羟苯甲酯（防腐剂）微溶于水，羟苯丙酯（防腐剂）不溶于水，DMDM乙内酰脲（防腐剂）。 含量0.10.6EDTA二钠：几乎不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。用于络合金属离子和分离金属。干扰物，但是没有氧化性三、实验步骤：（1）SOD提取：取大宝sod蜜 加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)（2）除杂蛋白：提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积）（3）SOD酶的沉淀分离： 剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。（4）粗酶液活性测定：提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。试剂/（mL）空白管对照管OD1提取液OD2粗酶液OD2酶液OD2PH8.3缓冲液33333样品000.10.10.1蒸馏水21.81.71.71.7室温放置20min邻苯三酚00.20.20.20.2（5）溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。提取液稀释：50 粗酶液稀释：20 酶液稀释：10 四、实验数据： 提取液粗酶液酶液总体积（ml）对照管（OD1）提取液（OD2）粗酶液（OD2）酶液（OD2）420nm吸光值提取液粗酶液酶液260nm吸光度值280nm吸光度值公式蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 0.74A260) 稀释倍数蛋白质浓度（mg/ml）五、实验结果及数据处理：（1）酶活力单位提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=（2）总活力提取液总活力U=活力单位总体积=粗酶液总活力=活力单位总体积=酶液总活力=活力单位总体积=（3）比活力提取液酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=粗酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=酶液比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度=