酿酒酵母不对称遗传分析(设计).doc

酿酒酵母不对称遗传分析生物科学 10300700042 周博言 周五下午108注：这个实验设计我上传了百度文库，老师如果在百度发现和我这个一模一样的设计不要误会，那个就是我设计的，不是我抄袭。原理在酵母细胞出芽过程中，细胞衰老造成的损伤在母细胞和子细胞之间的分配是不对称的，绝大部分损伤被母细胞所保留。然而，这种不对称遗传也不总是这样，在母细胞衰老到达一定程度时，它所产生的子细胞将不可避免地带有母细胞的部分衰老物质。酿酒酵母很早就被当做研究衰老的模式生物，早在1989年，Egilmez和Jazwinski就提出了“细胞质衰老因子”假说。1997年，Sinclair等人提出了酵母复制衰老的ERC积累学说，认为染色体外rDNA环ERC可能就是“细胞质衰老因子”。酿酒酵母rDNA座占整个基因组的10%，由编码rRNA的9.1kb重复单元串联重复100200个拷贝组成，定位于染色体。ERC可以通过胞内DNA加工系统的作用，由串联重复的rDNA经同源重组从基因组中切出。而ERC具有自身ARS（autonomously replicating sequence），能在每一次S期复制1次，而在母细胞内呈指数型增长。同时由于酵母细胞出芽分裂的不对称遗传，ERC在分裂时保留在母细胞中而不进入子细胞，从而使母细胞中大量积累ERCs。但随着母细胞持续地衰老，这种不对称遗传将无法维持下去，最终极度衰老的母细胞产生的子细胞中也将不可避免地带有ERCs。本实验将通过培养酿酒酵母，分离检测ERCs，对比不同代数母细胞产生的子细胞及衰老母细胞中ERCs的含量，验证酿酒酵母的不对称遗传。注：关于ERCs的不对称遗传的机制，Shcheprova等人提出了一种氯苄乙胺依赖的细胞核扩散屏障，它阻碍了母细胞核孔通向子细胞的通道。而环形DNA分子，比如ERCs，缺乏一种着丝粒序列而无法通过该屏障，最终被留在了母细胞中。尽管ERCs如何造成酵母细胞衰老的机制尚未明确，但很多假说已被提出。一种猜测是，ERCs会与那些在复制、转录过程中起重要作用的因子发生物理上的相互作用，从而使它们无法行使正常的功能。另一种可能性是，过多的ERCs导致了rRNA和核糖体蛋白之间数量的不平衡，进一步削弱了核糖体其本身的功能。而Ganley等人的研究则认为，ERCs通过诱导rDNA使其不稳定性限制了酵母细胞的RLS（复制型寿命），并且，他们认为这正是衰老的最根本的原因。材料酿酒酵母细胞培养基1（单位均为g）：葡萄糖25、酵母浸粉2、（NH4）2SO42、KH2PO45、MgSO47H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸馏水培养基2（单位均为g）：葡萄糖10、酵母浸粉2、（NH4）2SO42、KH2PO45、MgSO47H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸馏水仪器与试剂1. 仪器恒温摇床，高速离心机，振荡器，电泳仪，电泳槽，透视式紫外分析仪（或凝胶成像仪），离心管，摇瓶2. 试剂蔗糖、酵母质粒小提试剂盒中相关试剂（北京庄盟国际生物基因科技有限公司，也可采用其他公司试剂盒，那样步骤中数值可能要作改变）、琼脂糖、溴化乙锭等操作程序1. 酵母细胞的培养与分离（1） 活化：取适量酵母菌体，接入培养基1的摇瓶中，于30在150r/min摇床中培养24h，菌体密度约为4107个/ml。（2） 蔗糖梯度制备：于15ml（内径1.4cm，长11cm）离心管中自上而下铺加40%蔗糖溶液1.5ml，再加20%、10%及2%的蔗糖溶液各3ml制成不连续梯度。（3） 离心筛选：收集菌液，在800g离心力下离心5min，收集菌体重悬于1.5ml无菌水中。将菌体铺在蔗糖梯度溶液顶层，60g离心5min，收集最上层清液（约占总体积5%10%），得到的为刚脱离母体的芽殖细胞。（4） 同步培养：将得到的菌液转入50ml培养基2摇瓶，30下150r/min摇床中培养。2. ERCs的提取（参照部分质粒提取操作，部分地方改动以适应ERCs的提取）（1） 取1-5 ml 酵母培养物（不超过5107 酵母细胞），12,000 rpm (13,400g )离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。（2） 酵母细胞壁的破除：酶法：向菌体中加入300 l Lyticase buffer，充分混匀，并在摇床上220rpm/min，30处理1 小时。4000 rpm(1500g)离心10 钟，弃上清，收集沉淀。加入250l 溶液1（请先检查是否已加入RNaseA）重悬沉淀。注意：根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同，所用Lyticase buffer 的浓度和孵育时间应该进行适当调整。（3） 向管中加入250 l 溶液2，上下翻转68 次使菌体充分混匀，室温放置510 分钟。注意：混匀，略微用力。此时菌液应变得清亮粘稠。（4） 向管中加入350 l 溶液3，略微用力上下翻转68 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。9,000 rpm (13,400g )离心15 分钟。注意：溶液3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。（5） 小心地将上清液加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），9,000 rpm (13,400g )离心1 分钟，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。（6） 向吸附柱中加入500 l 去蛋白液W1，12,000 rpm (13,400g )离心1 分钟，倒掉废液。（7） 向吸附柱中加入600 l 漂洗液W2（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400g )离心1 分钟，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。重复此步聚一次。（8） 将吸附柱放入收集管中置于12,000 rpm (13,400g )离心2 分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。（9） 将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50100 l 洗脱缓冲液TE，室温放置2 分钟，12,000 rpm (13,400g )离心2 分钟将质粒溶液收集到离心管中。3. 实际步骤顺序（1） 进行操作1酵母细胞的培养与分离。（2） 取第0代细胞，即同步培养0h的细胞，提取ERCs，电泳并紫外检测（具体步骤不再赘述）。（3） 24h后，取菌液进行步骤1（3）离心筛选，取上清液和下层液体，分别提取ERCs，电泳并紫外检测。（4） 48h后（可略提前），取菌液进行步骤1（3）离心筛选，取上清液和下层液体，分别提取ERCs，电泳并紫外检测。结果预测与分析1. 0h：检测不到正常条带，因为此时出芽细胞中不带有ERCs，且酵母本身质粒拷贝数较低，无PCR基本难以检测，所以应该不会出现固定位置的明显条带。2. 24h：上清液中为出芽细胞，若以酵母代时2h计算，此时经过12代，还未足够衰老，ERCs不会进入所出芽体中（详细见原理），所以也不会出现固定位置的明显条带。下层液体中为已经一定程度衰老的细胞，产生ERCs，所以应该出现9kb左右条带，考虑超螺旋，应该显示小于9kb，但由于衰老程度不高，可能难以检测出，条带不够明显。3. 48h：上清液中的出芽细胞为高度衰老的酵母细胞产生，将会带有部分ERCs，可能出现9kb左右条带，考虑超螺旋，应该显示小于9kb，但因为量不是很多，条带可能不够明显。下层液体中大多为高度衰老的细胞，含有大量ERCs，应该会检测出比较明显的略小于9kb的条带。实验失败分析与建议以上实验结果为比较理想状况，但实际可能会出现一些问题。1. 酵母本身质粒对结果影响有多大，具体不是很清楚，如果酵母量较大可能会出现6kb左右条带。2. 此次电泳条带分子量较大，所选marker也要相应改变，而且要延长电泳时间或提高电泳电压。3. 根据理想状况，酵母代时2h，25代为极度衰老状态，所以我估计24h为中度衰老，48h（也就是24代）为高度衰老，但实际代时可能并不是这样，若提前衰老则可能死亡后ERCs进入上清液，则24h和48h的上清结果会受影响，若代时比2h长，则可能出现衰老程度不够，ERCs积累量不足的情况，使检测结果受到影响。所以时间可能要根据实际情况做相应调整。4. 由于ERCs是环状DNA而且只是比质粒略大，因此提取方法参考了质粒提取，实际情况可能会有些不同，虽然已经对数值及操作细节做了改动。5. 虽然ERCs最终是在酵母细胞中大量积累，但究竟能提取多少，显示情况如何我也不是很清楚。如果量不足，可能要进行PCR再检测，那样实验复杂程度会进一步增加，可以考虑改编成一系列实验。6. 衰老细胞虽然是处于下层液体中，但具体在什么位置不是很清楚，可能需要进一步实验摸索，来确定所取下层液体合适的