Chapter 4 酶分子修饰与应用.doc

第四章 酶分子修饰与应用1 酶分子修饰(Modification of Enzyme Molecule)：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。2 酶分子修饰的意义？（1）提高酶的活力；（2）增强酶的稳定性；（3）降低或消除酶的抗原性；（4）研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系。第一节 酶分子的主链修饰1 酶分子的主链修饰：利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。2 酶分子主链修饰的意义？（1）可提高酶的活力；（2）可降低或消除酶的抗原性；（3）可预测酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献。 （一）主链的切断修饰 主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。 主链断裂后，酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。这样可以提高药用酶的使用价值。 主链断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。（二）主链的连接修饰 将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体。第二节 酶的侧链基团修饰采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。酶的侧链基团的意义：（1）可以研究各种基团在酶分子中的作用，并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团。如果某基团修饰后不引起酶活力的显著变化，则可以认为此基团属于非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。（2）可以测定某一种基团在酶分子中的数量。采用三硝基苯磺酸测定氨基的数量；对氯汞苯甲酸测定巯基的数量；碳二亚胺测定羧基的数量；四唑重氮盐测定咪唑基的数量等。（3）可以提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，以提高酶的使用价值。（4）可能获得自然界原来不存在的新酶种。例如，某些抗体酶和人工改造的核酸类酶等。（一）氨基修饰氨基修饰：采用氨基修饰剂（能使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物）使酶分子侧链上的氨基发生改变，改变酶蛋白的空间构象，从而使酶的稳定性大大提高的方法。常用的氨基修饰剂有亚硝酸、2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS）、2, 4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）等。二、羧基修饰羧基修饰：通过修饰剂（可与蛋白质侧链上的羧基发生反应的化合物）与酶蛋白侧链的羧基发生酯化、酰基化等反应，使蛋白质的构象发生改变，用于定量测定酶分子中羧基数目的方法。常用的修饰剂有碳二亚胺、重氮基乙酸盐、异嗯唑盐等。三、巯基修饰巯基修饰：采用修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基（半胱氨酸）结合，使巯基发生改变，从而显著提高酶的稳定性的方法。 常用的修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇等。四、胍基修饰胍基修饰：采用修饰剂（二羰基化合物）与酶蛋白侧链上的胍基（精氨酸）反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子构象的方法。常用的修饰剂有丁二酮、丙二醛、苯乙二醛等。五、酚基修饰酚基修饰：通过修饰剂的作用使酶分子上的酚基（酪氨酸）发生改变，从而提高酶的催化活性，增强酶的稳定性的方法。六、咪唑基修饰咪唑基修饰：通过修饰剂的作用使酶分子中的咪唑基（组氨酸）发生改变，从而改变酶分子的构象和特性的方法。常用的修饰剂有：碘乙酸，焦碳酸二乙酯。七、吲哚基修饰吲哚基修饰：通过改变酶分子上的吲哚基（色氨酸）而使酶分子的构象和特性发生改变的方法。八、分子内交联修饰分子内交联修饰：利用双功能试剂使酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶分子稳定性的方法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺等。九、大分子结合修饰大分子结合修饰：修饰剂（水溶性大分子）与酶蛋白的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而提高酶活力，增加酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性的方法。是目前应用最广泛的酶分子修饰方法。常用的修饰剂有聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、环状糊精、羧甲基纤维素等。PEG具有溶解度高，既能溶于水，又能够溶于大多数有机溶剂，通常没有抗原性，没有毒性，生物相容性好等特征，成为目前应用最为广泛的大分子修饰剂。十、亲和修饰亲和修饰（位点专一性修饰）：是指修饰剂（亲和标记试剂）只专一地与酶分子某一个位点上的某一个基团发生反应，而与此位点以外的同一种或不同种基团都不发生作用的方法。第三节 酶的组成单位置换修饰 酶蛋白的基本组成单位是氨基酸，将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。酶RNA的基本组成单位是核苷酸，将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法，称为核苷酸置换修饰。通过酶的组成单位置换修饰，可以提高酶活力、增加酶的稳定性或改变酶的催化专一性，常用的技术为定点突变。定点突变(site directed mutagenesis)：指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下。1新酶分子结构的设计：根据已知酶在催化活性、稳定性、抗原性和底物专一性等方面存在的问题，设计出欲获得的新酶的核苷酸或氨基酸排列次序。2突变基因碱基序列的确定：对于核酸类酶，根据欲获得的酶RNA的核苷酸排列次序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及其位置。对于蛋白类酶，根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的mRNA上的核苷酸序列，再依据互补原则，确定此mRNA所对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及其位置。3突变基因的获得：根据欲获得的突变基因的碱基序列及其需要置换的碱基位置，合成引物，通过PCR技术获得所需基因。PCR技术（聚合酶链反应技术）：是木里斯(Mollis)1985年发明的DNA扩增技术。该技术的基本过程包括：双链DNA的热变性(解链)，引物与单链DNA的退火结合，引物的延伸等3个步骤，这3个步骤反复进行，一般经过30次循环，可使目的基因扩增几百万倍。第四节 金属离子置换修饰金属离子置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，了解各金属离子在酶催化过程中的作用，从而阐明酶的催化作用机制，并有可能提高酶活力，增强酶稳定性，改变酶的某些动力学性质的方法。有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性；若进行金属离子置换，可能提高酶的活力或增加酶的稳定性。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。金属离子置换修饰的主要过程：在酶液中加入金属螯合剂形成螯合物将螯合物除去加另一种金属离子到酶液中，酶蛋白与新加入的金属离子结合得到新酶。在经过分离纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂（乙二胺四乙酸(EDTA)），使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态用一定量的另一种金属离子加到酶液中，酶蛋白与新加入的金属离子结合，就可以得到经过金属离子置换后的酶。第五节 酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰：通过各种物理方法（高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH值、有毒环境）使酶分子的空间构象发生某些改变，而改变酶的某些特性和功能，从而提高酶的催化活性，增强酶的稳定性或改变酶的催化动力学特性的方法。酶分子物理修饰的特点：不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变。只是使副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生某些改变。第六节 酶分子修饰的应用（一）在酶学研究方面的应用（1）酶的活性中心研究：如果某基团经过修饰后不引起酶活力的显著变化，则可以认为此基团不处在酶的活性中心位置；如果对某基团进行修饰以后，酶活力显著降低或完全丧失，则此基团很可能是酶催化中心的必需基团。（2）酶的空间结构研究：采用具有荧光特性的修饰剂对酶分子的侧链基团进行修饰，借助荧光光谱研究，可以分析各基团在酶分子中的空间分布情况，了解在溶液中酶分子的空间构象。（3）酶的作用机制研究：通过酶分子修饰作用，可以了解各种残基及其侧链基团在酶催化过程中的作用。（二）在医药方面的应用（1）降低或者消除酶抗原性，如具有抗癌作用的精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰，其抗原性被消除。（2）增强医药用酶的稳定性，如用亚硝酸修饰L-天冬酰胺酶，使其氨基变成羟基，经过修饰后，酶的稳定性大大提高，在体内的半衰期延长2倍。（三）在工业方面的应用（1）提高工业用酶的活力，如将锌型蛋白酶的锌离子除去，然后加进钙离子，置换成钙型蛋白酶，其酶活力可以提高2030。（2）增强工业用酶的稳定性，如胰蛋白酶通过物理修饰后，在50的条件下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高5倍。（3）改变酶的动力学特性，如葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰后，葡萄糖异构酶的最适pH值下降0.5单位，并增强了酶的稳定性，更加有利于果葡糖浆和果糖的生产。（四）在抗体酶研究开发方面的应用抗体是由抗原诱导产生的与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。在抗体与抗原的结合部位引进催化基团，就有可能产生抗体酶。抗体酶是一类具有催化功能的抗体，是原本在自然界不存在的新酶种。（五）在核酸类酶人工改造方面的应用对某些核苷酸残基进行修饰，连接上氨基酸等有机化合物，就有可能扩展核酸类酶的结构多样性，从而扩展其催化功