22. Sulforaphane Inhibits Human MCF-7 Mammary Cancer Cell Mitotic.doc

萝卜子素抑制人类MCF-7乳腺癌细胞的有丝分裂和微管蛋白聚合的研究进展摘要 萝卜子素（SUL）是一种采自芜菁和其他十字花科蔬菜中萝卜甙水解产物中的异硫氰酸盐，结果表明它可以诱导第二阶段的解毒酶，对啮齿类动物的乳腺肿瘤起到化学抑制。而最近，又发现它可以诱导细胞阻滞和使结肠癌细胞凋亡。在目前的研究中，我们证明了SUL对人类乳房的腺癌细胞增殖也有一直作用。用15 mol/L 的SUL(P 0.05)同步治疗MC-F7细胞导致明显的 G2 / M细胞周期阻滞(167% of control)而增加的cyclin B1蛋白质(175% of control)进行24小时。此外，15 mol/L 的SUL(P 0.05)明显的诱导H1组蛋白磷酸化，在细胞有丝分裂的早期就开始阻滞(10-fold increase over control)，而且破坏在体内进行的有丝分裂微管的聚合。随后显露纯化后的牛脑微管蛋白加入相对高剂量的SUL中明显的(P 0.05)的抑制体内的微管蛋白聚合率（51% of control)和总微管蛋白聚合 (78% of control) 。此外，纯化微管蛋白的聚合物加入异硫氰酸盐萝卜子素的相似物之后也有相似的抑制作用。总结起来，这些研究发现表明，SUL具有对乳房细胞的持续作用，包括有丝分裂细胞周期阻滞和提出了一个破坏正常微管细胞聚合的机制还有对微管蛋白动力学的一些微妙的作用。关键词：有丝分裂阻滞，微管聚合，人类的乳房癌萝卜子素是一种采自芜菁和其他十字花科蔬菜中萝卜甙水解产物中的异硫氰酸盐，它通过植物内在的葡糖硫苷溶菌酶从硫代葡萄糖酸盐与硫代葡萄糖苷复合物中水解出来。由于以下几个原因SUL在营养和乳腺癌的研究领域里得到了许多的关注。第一，一些流行病学研究表明乳腺癌风险与吃蔬菜具有相反的关系。SUL是一种常见消费植物里的成分，尤其在花椰菜中含量丰富。第二，口服的SUL被证实可以化学抑制老鼠的乳房肿瘤。最后，SUL被证实可以诱导第二阶段的解毒酶而且可以完全抑制处于第一阶段的同工酶2EI和细胞色素P450，-这是一种参与致癌物质活化的物质。因此非常关注SUL可以在癌症初期进行抑制的潜力。最近,SUL被证明具有抑制肿瘤细胞的增殖的作用,阻止细胞周期进展在G2 / M，诱导凋亡，还有调节信号转导途径，表明它可能作为一种对癌症的发展有效的抑制剂。第一个报道的SUL具有抗增殖作用的证据是刊登在 Gamet-Payrastre 上的。在那些研究中HT29人类克隆癌细胞加入 15 mol/L SUL 被证明G2/M细胞周期增加并且B1细胞周期蛋白在24小时内表现出增加。经SUL处理的细胞体现出巴克斯表现提升。亚乙烯氟四氟乙烯共聚物 聚合酶 产生分裂，然后用核染色质冷凝48小时，电磁感应可以标示细胞凋亡的数目。苯乙基异硫氰酸甲酯，类似于SUL是一种硫代葡萄糖酸盐来自许多十字花科的蔬菜，也观察到类似的细胞反应诱导，包括剂量-时间相关凋亡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活。激酶p34cdc2或cdc2 (CDK1)的作用被确定，它作为管理从G2到有丝分裂的细胞周期进展的钥匙还有细胞死亡通路的开始。具体的说，cdc2的作用通常被认为参与苏氨酸161的磷酸化，绑定的cyclin B1，对苏氨酸14和酪氨酸15具有去磷酸化作用。磷酸化和随后的cdc2去磷酸化作用。额外的收获的是认识到了cdc2不太恰当的作用：它会导致一系列细胞的死亡，已知的有丝裂灾变。例如，FT210乳房癌的近亲繁殖的细胞，提升cdc2的活性显示适应片段素-2-感应机制。此外Fotedar用t细胞杂种细胞使用近亲繁殖，结果是激活了细胞凋亡机制，提高了cdc2的激酶活性，在G2/M细胞周期出进行抑制，并且cdc2G2/M在细胞周期过渡的活性是一个很重要的因素，它决定了在有丝分裂进程中是否发生细胞周期阻滞或者细胞凋亡周期时候开始。 多种多样的天然成分能够不均匀的化学结构被观察到通过有丝分裂期捕获细胞浸润破坏和微机制存在剂量依赖涉及触发最终因凋亡细胞死亡。长春花生物碱的物质,如在相对较低,长春花碱浓度,直接照射微管蛋白蛋白质和诱导细胞周期阻滞的有丝分裂像由于干扰正常的微动态。另一方面,相对高剂量也引发逮捕,但有丝分裂像 微管蛋白显著的抑制机制包括聚合和生产总结合微管的有丝分裂像(45年)。有丝分裂逮捕所引发的低的特点,显形长春花碱剂量的前中期抑制1或2染色体不代表大会与纺锤体相整合板,中期短,或是动物比平常更多的动物。随着长春花碱的浓度,这些畸变正常中期变得更加明显,双极主轴,没有一个单极的。最终,在相对较高的剂量,长春花碱相互结合位点的低相似度在微管蛋白蛋白质和生产有丝分裂由浓缩染色体蕴本质上缺乏的微管。长春花生物碱长春花碱是的这3现在确认了机械类(例如,长春花生物碱、秋水仙素,（紫杉烷类)的自然和半合成的微管蛋白化合物。虽然这些分类的基础上,结合特征微管蛋白/微核以及随后的表型逮捕,新发现的基本要求有丝分裂阻滞化合物被划分为直接微管蛋白破坏药物抑制能力的聚合反应的净化微管蛋白体外制度欠缺微管联系的蛋白质和血清生长因子。原料和方法细胞培养。MCF-7人类乳房上皮细胞细胞系，是孤立的恶性腺癌细胞可以从ATCC得到，被用于细胞培养实验。斯托克细胞通常在伊格尔试剂中培养，含10%高温灭火胎儿牛血清孕37C在5%的二氧化碳的环境下；每48小时中间被改变。除另有规定外,播种后进行更换；培养与G/S加羰基脲同步进行(1 mmol/L, 16 h), 其次是短暂的清洗，然后更换培养基，加SUL活二甲基亚砜，之后完成同步时期共2小时。一些实验计划研究和证明SUL在细胞系增殖和在其他乳腺癌细胞系细胞周期的分布。防止潜在的混杂致病的影响而造成的扩散使用各种不同的细胞培养的媒介，ER+MCF-7细胞系和ZR-75 ，和 tERBT-20 细胞系和 MDA-MB-231,所有的传代都是在以下的培养基中完成的:伊格尔试剂含有5%高温灭活的胎牛血清。在这些试验中，SUL和DMSO在传代后一共48到12小时。胸腺嘧啶的DNA合成检验。MCF-7细胞播种在48孔板上密度为1.25 x 104 /细胞/cm2。培养的胸腺嘧啶加入更多剂量的SUL和DMSO。48小时后，倒掉培养基，用PBS洗涤细胞，用5%的三氯乙酰酸性处理15分钟，沉淀用纯甲醇清洗；在五分钟后，样品,测量了贝克曼LS6500闪烁柜台的存在ScintiVerse SX16-4(费舍尔数鸡尾酒。比较扩散的影响在SUL珥+和呃-人类乳房癌细胞系,MCF-7,ZR-75,BT-20 MDA-MB-23细胞,每个人都是同样的放在附加实验(见上表)。细胞周期分析和量化有丝分裂图像。MCF-7细胞被播种(1106细胞/ 75平方厘米文化瓶),治疗15mol / LSUL或DMSO指定的时期,通过胰蛋白酶化收获。接下来这些细胞被用水清洗,固定在70%乙醇形态学(至少12小时,4C),再清洗一次暂停一下晶状体形态学Vindelov的DNA染色后的解决方案(100毫克/升0.1%核糖核酸酶 NP-40,250毫克/升,碘化物propidium PBS)109细胞密度/升左右。荧光法结40:9 1小时后使用库尔特用流式细胞仪流动。比较的影响细胞周期分布在SUL的ER+和ER-人类乳房癌细胞系,MCF-7,ZR-75,BT-20 MDA-MB-23细胞,每个人都是同样的放在附加实验(见上表)。在有丝分裂细胞进行量化,MCF-7细胞被播种、治疗、收获一洗(如上)在暂停后在美国,显微镜载玻片上。然后沾有瑞氏-姬姆萨细胞染,并有丝分裂的比例决定至少每10细胞分析6个领域下或者幻灯片光镜观察。西方墨点分析法。MCF-7被播种然后被15 mol/L SUL 或 DMSO处理几次。用TBS清洗细胞两次，在冰缓冲剂中取出，白细胞，之后离心沉淀 (15,000 x g 离心15 min 在4C). 化验上清液中的总蛋白和整部分相等的蛋白质含量间通过聚丙烯酰胺凝胶电泳到硝酸纤维素膜。这些膜被封锁，然后被孵化为多克隆抗体至细胞周期蛋白B1或者一个克隆磷光体特效抗体至H1组蛋白。培养后,过氧化物酶结合的山葵的二次抗体从适当的物种,i免疫检测进行,阿默舍姆使用化学发光(生命科学)。那暴露的x光胶片当时Adobe Photoshop,扫描成光密度分析以G4的苹果电脑进行公共领域的个人电脑使用的程序在发达的国家卫生研究院(NIH)图像(美国国立卫生研究院和在因特网上可得到的）平等的加载得到证实,约占总蛋白质的. 从而更适用于再杂交的膜肌动蛋白(sc-1616)。免疫荧光染色。MCF-7细胞被稀疏的种于12mm的玻璃原片上，加入15 mol/L SUL或者DMSO 放置24 h。之后用PBS洗一次，细胞再用戊二醛固定接着用硼氢化钠。用PBS洗三次，用缓冲液处理十分钟，然后孵化一个单克隆抗体至a-微管蛋白在室温下三十分钟。之后用缓冲液洗5次，细胞被孵化成同一个异硫氰酸荧光素次要的抗体，然后DNA被DAPI(10 mg/L) 在室温下30分钟。最后，样本用缓冲液洗5次，一次用dH2O，安装在显微镜滑动同封固剂，然后用荧光显微镜分析。体外微管蛋白聚合法。外消旋的D,L-SUL作用和单独的D-SUL和L-SUL异构体及SUL腈、甘油三芥酸酯是一样的，微管蛋白聚合在体外被检验。培养中，这些化合物被选出来区分一个特别体现在拆分或化学基SUL可能给了全微管蛋白聚合破坏活动中观察到的。牛脑血清在配置好的D,L-SUL、SUL腈、D-SUL、L-SUL、甘油三芥酸酯或者SUL和DMSO中被孵（96孔板 37）。吸光度读数是在340nm处完成，分子器件光谱马克斯加上板每分钟1小时读数根据组件的指示。微管蛋白聚合的速率是当时每个样本计算于线性部分动力学曲线,并分析组平均值率无统计学意义。此外，组被分析为差异总共微管蛋白聚合(最大milli-od340单位)最后一小时的过程。统计分析。分析比较两个方法的实验数据，用独立的t检验和伴随检验检测方差。就实验而言需要比较大于两种实验方法，方差分析遵循Tukeys Studentized Range，并逐对对照。所有统计都用SAS系统完成。复制的实验被独立分析，而且所得的数据是在单一实验取得的。在p0.5处显著的差异被建立并且被标记星号。结论SUL抑制乳腺癌细胞的增殖。用30 mol/L的SUL对MCF-7进行同步的处理，在一定剂量的下可以抑制细胞增殖。在48小时内，SUL剂量大于10 mol/L（p0.05）可以抑制DNA的合成（图1）。而且SUL浓聚物大于等于15 mol/L的生产效率和其他的浓度一样，所以15 mol/L这个浓度被选择为细胞培养的不变量研究SUL对MCF-7作用的时间变量。此外，我们发现剂量低于 1 mol/LSUL对在ER+及ER-细胞中的DNA合成有明显的抑制作用（图2）。SUL延迟 G2/M的开始及诱导有丝分裂细胞周期的停滞。标出细胞数的标准曲线并同步确定疗效，我们加入DMSO或者15 mol/L SUL 48小时之后用流式细胞仪来分析，可以确定细胞周期的分布（图3）。我们发现当立即脱掉羰基脲的时候，百分之八十的细胞处于细胞周期的G1阶段，但是周期中这个控制会脱离G1阶段而且在45小时内完成。而且12小时候用DMSO处理的控制细胞的高峰在G2/M阶段，然而加入15 mol/L 的SUL 在18小时后才能达到峰值。在处理12小时后，SUL诱导延迟G2/M的开始与在G1阶段细胞的百分数有关（图4A)。然而在处理24小时后，SUL诱导G2/M显著增加（图4B），而且一个相似的G2/M阻滞在之后的时间（48和72小时）被观察到，数据并没有显示。不同步的，在24小时随机细胞周期的MCF-7对SUL的诱导在G2/M的阻滞十分敏感（图4D）。但是，抑制的数量少于同步处理的细胞。另外，用SUL异步处理12小时的细胞在G1阶段并没有累积的现象（图4C）。此外，在SUL浓度低到5 mol/L的时候在ER+和ER-细胞系中均引起相似的累积在G2/M阶段（图5）。用15 mol/L的SUL同步处理在MCF-7细胞系，24小时后细胞周期蛋白B1和磷酸化组蛋白H1增加（p0.05）（图6），标出了cdc2激酶的活性和G2阶段后细胞周期的进展。MCF-7加入15 mol/L 的SUL ，之后用吉姆萨试剂染色，24小时后，许多细胞在细胞周期的初期阶段或者近似初期阶段伴随着在细胞周期中期的不均衡的同源染色体的浓缩；72小时后，核变形及微核化十分明显（图7）。SUL破坏有丝分裂的微管。荧光免疫检验法检测微管蛋白与DNA细胞染色显示了相似的表型细胞有丝分裂图像的早期。在一些情况下,SUL诱导时还伴有异常的无有丝分裂微管（图8）。在体外SUL和异硫氰酸盐的对照组可以抑制微管蛋白的聚合。D-SUL 、L-SUL 、D,L-SUL、异硫氰酸盐、甘油三芥酸脂SUL（p0.5)被发现在体外均有抑制微管蛋白聚合的能力。而且在一个缺少异硫氰酸盐的微管蛋白组加入SUL腈之后，在处理之后表现出了本质上相同的蛋白聚合型（图9和表1）。图1图2图3图4图5图6图7图8图9表1讨论 目前的报告描述了在乳腺癌细胞中SUL诱导有丝分裂停滞和微管中断，而且证明了事先在老鼠乳腺细胞中SUL结构相似的物质的作用。我们证实SUL 诱导G2 / M细胞周期停滞,以及细胞培养异步MCF-7(图4)。此外,类似的G2 / M积累过程进行了观察,ZR-75 BT-20,MDA-MB-231细胞,让我们想到SUL在乳房癌癌细胞的潜在治疗的效果的地位。24小时内,诱导 G2 / M积累相关的MCF-7细胞同步提升的证明明细胞周期蛋白B1蛋白和cdc2激酶激活(图6)。此外,SUL-treated细胞显示染色体或者散布在国家初期相似(图7D),显示细胞周期阻滞前还在有丝分裂中期。有趣的是,这些早期的有丝分裂是缺乏正常的主轴微管(图8),暗示了有丝分裂像SUL诱导机制涉及摄动逮捕微管蛋白聚合和/或微动态,据报道在此前其他自然发生的抗有素分裂。此外,我们还观察到MCF-7细胞暴露SUL期超过24小时产生微核化及产生分裂和异常(图7）这些发现证明从我们以前的研究中,我们形态特征以及分子标记SUL诱导相关凋亡使老鼠的乳房癌细胞系停滞在M阶段。体外试验表明,相对较高的SUL剂量的速度明显抑制聚合、最大聚合、纯化后的微管蛋白蛋白质。