苏氨酸的N烷基化研究.doc

2010届本科毕业论文 2010年5月苏氨酸的N烷基化研究（甘肃省高分子材料重点实验室 西北师范大学化学化工学院 兰州 730070）摘要：N烷基化后的氨基酸具有抗菌性和抑制肿瘤等生物效应，在生物医药方面有一定的应用前景。另外，一些N烷基化后的氨基酸（如苏氨酸）不仅具有很好的生物相容性和降解性，还可作为pH敏感聚合物的单体。我们通过优化原料比例、pH值等合成了N,N-二甲基的苏氨酸。合成方法简单，原料廉价易得，并通过傅里叶变换红外光谱，核磁共振氢谱，碳谱等表征了该化合物的结构。关键词： 氨基酸, 苏氨酸, N烷基化, 甲基化 Research on N-alkylation of Threonine Yandie-Chen Xingli-Shi Dedai-Lu Ziqiang-Lei(Key Laboratory of Polymer Materials of Gansu Province, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nothwest Normal University, Lanzhou 730070,China)Abstract: N alkylated amino acids have some biological effects, such as antibacterial activity, inhibition of tumor and have some promising applications in biological medicine .In addition, some N alkylated amino acids (eg threonine) not only have good biocompatibility and biodegradability, also can be used as the monomer of pH-sensitive polymers. We synthesized N, N-dimethyl-threonine by optimizing the ratio of raw materials, pH value and other conditions. The synthesis method is simple and raw materials are cheap and can be easily obtained. The structure of the compound has been characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance 1H and 13C spectra.Keywords: Amino acid, threonine, N-alkylation, methylation第一部分 文献综述引言-氨基酸是多肽、蛋白质合成的基础，除了天然的20种氨基酸为人体所必需外,自然界已发现了非天然氨基酸1000 多种1。这些氨基酸在生物体内的氧化、还原、水解以及 C-C 键形成的反应过程中起重要作用,并决定了多肽、蛋白质的性质,特别是光学纯 -氨基酸及其衍生物在生理、药理方面有着广泛的用途。随着科学的进步和实验手段的提高,许多多肽及蛋白质的结构不断地为人们所认识和了解。通过合成不对称的 -氨基酸来模拟多肽、蛋白质的合成，探索遗传基因工程新的尖端领域,是近年来化学领域研究的焦点之一2。天然苏氨酸为L-苏氨酸（L-Threonine）也称-羟基-氨基丁酸。苏氨酸在生物化学中是一种生糖兼生酮氨基酸。它是人体八种必需氨基酸之一，其主要作用是维持身体蛋白质平衡，促进正常生长。此外，它还支持心血管，肝，中枢神经和免疫功能系统。苏氨酸有助于保持整个身体的结缔组织和肌肉强大和富有弹性。它的其他作用还包括建立强大的骨骼和牙齿珐琅质，并可以加速伤口愈合和损伤恢复。这种氨基酸对治疗某些类型的抑郁症有一定疗效，它还有助于治疗肌萎缩侧索硬化症。它也是一种重要的营养强化剂，有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，苏氨酸对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素单酰胺菌素的原料。目前，德国科学家在人体血液中发现了一种苏氨酸，实验发现，它可以阻止艾滋病病毒附着和侵入体细胞，这为抗艾滋病药物的研制提供了路径。人类不仅发现氨基酸，还发现无论从分离的海洋生物还是微生物中，N 烷基化的氨基酸是构成各种天然肽和缩酚酸肽（depsipeptides）如环孢素，海兔毒素（dolastatins）和膜海鞘素（didemnins）的结构单元3。这类由 N 烷基化氨基酸构成的生物分子共同特点是具有增强的水解稳定性，独特的构象性质，更高的亲油性能如增加细胞膜通透性，并改变构象特征或氨基酸的一些属性。这些性质将导致明显而又广泛的生物效应，包括抗生素，抗癌，抗病毒和免疫抑制活性等。N-甲基氨基酸也是非常有用的工具。由氨基酸 N-甲基化修饰的单个或多个肽构成的化合物，如蛋白质，在药物化学中有广泛应用 4。这类化合物常用于氨基酸及多肽衍生物构象研究。由于 N 的甲基化限制了多肽骨架的灵活性，从而减少形成异构体的数目。故这类化合物对于获得多肽的骨架结构形式和结构活性信息都有重要作用，可以稳定各种肽的基本构象（如 螺旋和 折叠）。这种 N-烷基化修饰还影响了多肽与受体的相互作用，与无甲基化的前体相比也明显地增强了其生物活性。如 N-烷基化的氨基酸（包括单烷基化和双烷基化）与金属离子形成配合物时会影响配合物的空间结构，进而影响其生物功能5。同时，包含 N-甲基氨基酸的多肽物对于蛋白酶具有更强的抗降解性。鉴于以上原因，此类氨基酸的烷基化衍生物的合成显得尤为重要。MrMsson6等人用壳聚糖和壳寡糖聚合物作原料，与碘甲烷经甲基化反应，发现在酸性条件下质子化的 N-单甲基化和 N，N-二甲基化的氨基酸基团对抗菌活性显得很重要，而且 N-季铵化后其抗菌活性也增加。从氨基酸的N-甲基化角度出发，氨基酸的N-甲基化（烷基化）方法是伴随着多肽类天然药物的发展而发展的，同时又对多肽类天然化合物的合成起到巨大的推动作用。其用于氨基酸的N-甲基化（烷基化）的方法7主要有五种：1.直接甲基化方法，即采用CH3I、硫酸二甲酯等甲基化试剂进行甲基化的方法，是目前使用最广泛的方法之一，但存在消旋化、产品不易分离及底物氨基酸分子种类存在局限等问题；2.还原胺化法，即氨基与醛或酮反应后再还原的方法，也是一种常用的方法，但由于还原剂成本较高、产品及废液中含有毒物质，限制了此方法的使用；3.通过生成噁唑烷酮中间体再开环得到甲基化产品的方法，是一种可广泛应用于大多数天然氨基酸N-甲基化的方法；4.苯基烷基化法；5.其他特殊方法，如-叠氮酸类化合物的还原烷基化，应用Mitsunobu 反应，应用亚胺氮正离子的逆Diels-Alder 反应等方法。1.直接甲基化方法，直接甲基化的方法很早就得到了应用，主要的方法有Olsen 和Benoiton 等采用的CH3I 法8-9、Hlavacek10等采用的硫酸二甲酯法。1.1 CH3I 法，在碱的作用下用碘甲烷做甲基化试剂来完成 N-甲基化反应，简称为 CH3I 法。根据所采用碱的不同，此方法又分为 Ag2O/CH3I 法、NaH/CH3I 法及 K2CO3/CH3I 法。1.1.1 Ag2O/CH3I 法，Olsen8 等选择了几种Cbz（苄氧羰基）保护或Boc（叔丁氧羰基）保护的氨基酸，用 CH3I 和 Ag2O 在 DMF (N,N- 二甲基甲酰胺)中反应，以较高收率得到相应的 N-甲基化氨基酸系列化合物。实验结果表明，甲基化反应并没有造成氨基酸的消旋，得到的甲酯通过温和皂化反应得到相应氨基保护的 N-甲基化氨基酸。此方法反应条件比较温和，且反应过程中没有发生外消旋。但得到的产品是相应的甲酯，下一步进行多肽偶合时需要皂化脱甲酯。且由于氧化银不稳定，反应需要在无水及避光条件下完成，因此该方法只适用于实验室小规模使用。1.1.2 NaH/CH3I 法，Benoiton9 等采用NaH 做碱夺去 N 上 H 质子后，用 CH3I 进行甲基化反应，得到较高收率的相应的 N-甲基化氨基酸衍生物。Cbz 和 Boc 保护的氨基酸用NaH（3eq )和CH3I ( 8eq )于THF 中在室温下反应，可以选择性地发生甲基化而不发生酯化。此方法是目前广泛应用于氨基酸或多肽N- 甲基化的方法11-12，在很多天然多肽全合成中被采用。1.1.3 K2CO3/CH3I 法，随着氨基酸保护试剂的发展，CH3I 法也得到了进一步的发展。鉴于 Bts 保护氨基酸具有较好稳定性，此类氨基酸的N-甲基化可以用 K2CO3 做碱于 DMF 中用 CH3I 以较高收率完成。1.2 硫酸二甲酯法，Hlavacek 10a等用硫酸二甲酯对丙氨酸和缬氨酸进行了直接甲基化法，采用的方法分别是：将对甲苯磺酰基保护的 L-丙氨酸采用 Brenner 法将其制成相应的异丙酯，然后在 NaOH 水溶液的作用下用硫酸二甲酯进行 N-甲基化，脱氨基保护后得到 N-甲基-L-丙氨酸，收率为67%；N-甲基-L-缬氨酸是制成叔丁酯后采用相同的方法得到的，收率为65%。文献采用相同方法得到纯度较高的 N-甲基化氨基酸系列化合物，并直接用于下一步多肽的合成。但此方法没有应用于含有其他官能团氨基酸的甲基化。Mahavir Prashad13等对此方法进行了改进，将 Boc 保护的氨基酸或二肽于THF 中在NaH 作用下用硫酸二甲酯进行甲基化，反应中加入少量水进行催化，成功地以高收率得到了一系列 Boc 保护 (L)-N-甲基化的氨基酸或二肽。如当氢化钠与水和硫酸二甲酯物质量之比为46：2：31的时候，N-甲基化的Boc- L -缬氨酸，Boc -L -苯丙氨酸，Boc -L - 3 -（2 -萘基）丙氨酸， Boc -L -亮氨酸，1-（Boc-氨基）环戊酸的收率分别为91%，90%，80%，92%和85%（Scheme 1）。Scheme 11.3 溴代酸的亲核取代法 14，-溴代酸与甲胺反应生成N-甲基氨基酸，反应后产物发生瓦尔登构型转化（Scheme 2）。Scheme 22还原胺化法，氨类的 N-烷基化通过与醛或酮反应再进行还原胺化来完成，也是一种常用的方法。将氨基保护的氨基酸与甲醛反应后用甲酸还原，直接得到 N-甲基化产品，脱氨基保护后得到相应的 N-甲基氨基酸。如 Fmoc 保护烷基化法15，目前，这种方法仅对 -氨基酸有报道。用芴甲氧羰基(Fmoc)对氨基酸的氨基进行保护，再在酸性条件下与醛反应环化，然后用三乙基硅烷(TES)还原开环。反应结束后脱去 Fmoc，就可以得到高产率的单烷基化产物。该法广泛用于 -氨基酸的氨基单烷基化反应。 如果是非 -氨基酸，可以采用下面改进的方法。同样，首先需要用 Fmoc 将氨基保护起来，在三氟乙酸(TFA)和三氯甲烷体系中, 滴加甲醛溶液，半小时之后加入稍过量的 TES 进行还原，反应在几分钟内便可完成。这种方法十分方便,整个反应和纯化在当天内就可完成。氰基硼氢化钠(NaBH3CN)也是一种比较常用的还原试剂，氨基酸无需保护与醛或酮在 NaBH3CN 的作用下得到N-单一烷基化的氨基酸无机盐。Robin Polt16等使用氨基酸/酯对的 ODonnells Schiff 碱和甲醛水溶液及 NaBH3CN 还原胺，其次催化加氢（Scheme 3），合成N单甲基化氨基酸和氨基酸酯类，且获得较好的产率。在大多数情况下，使用非质子溶剂乙腈，但由于溶解度的问题，部分反应用四氢呋喃进行。他们这种方法可用于合成天然产品 L 型阿卟啉的 N-甲基-L-色氨酸，（四维），不用与皮克泰-斯宾格勒环化反应竞争。文献还报道了一种温和且有选择性的还原剂三乙酰氧基硼氢化钠来替代氰基硼氢化钠，不会产生有毒的副产物。i. NaBH3CN, or THF, AcOH; ii. HCHO,NaBH3CN, pH5-7; iii. H2, Pd/C, MeOH or EtOH; iv. HCOR, NaBH3CN, pH5-7; v. H2, Pd/C, AcCl, MeOH or EtOH. Scheme 33 噁唑烷酮中间体法，Luke17等将化合物的氨基先与甲醛反应，然后直接用三乙基硅烷还原，烷基化与还原步骤同时进行。此方法并不局限于-氨基酸的反应。此方法可以广泛应用于大多数氨基酸的N-烷基化，且不需要对侧链进行保护。只有那些带有碱性侧链的氨基酸不能完成噁唑烷酮的形成，如赖氨酸（Lysine）、组氨酸（Histidine）和色氨酸（Tryptophan）。（Scheme 4）4.苯基烷基化法，芳卤可以对氨基酸或氨基酸酯进行直接单芳基衍生化反应。Rttger18等以溴苯为原料，采用碘化亚铜催化，在水体系中发生反应，产率可达78%。还有一种直接在氮原子上引入一个苯基的方法，可以采用苯胺和二苯基碘盐进行反应,在苯胺上引入一个苯基。Scheme 45. 其他方法，除了以上几种方法，还有许多其他的特殊方法用于氨基酸或多肽的N- 甲基化（烷基化）反应。-叠氮酸类化合物用二烷基溴化硼进行还原烷基化，可以得到相应的N-烷基化产品19，且构型保持不变。N-Pmc（五甲基苯并二氢吡喃-6- 磺酰基）保护的氨基酸酯可以与不同的醇发生Mitsunobu 反应后再脱保护得到N-烷基化的氨基酸20。还有一种特殊的方法是基于亚胺氮正离子的合成方法，即通过逆Diels-Alder 反应对二肽或氨基酸类化合物进行N-甲基化21（Scheme 5， Scheme 6， Scheme 7）Scheme 5Scheme 6Scheme 7上述方法中，Ag2O/CH3I法只适用于一个氨基和一个羧基的氨基酸，对于含有其他官能团的氨基酸不能得到目标产物，如Arg （精氨酸）、Asp （天冬氨酸）、Glu （谷氨酸）、Met （蛋氨酸）、Ser （丝氨酸）或Thr （苏氨酸）等。对于NaH/CH3I法，大多数此类反应都不能使N-甲基化进行完全，产品中混有原料，因此必须用柱色谱进一步分离纯化才能得到N-甲基化产品，限制了其大规模的应用。有些反应还存在外消旋现象（12%），此方法的反应条件还有待进一步完善。还原胺化法是一种较好的方法，但用NaBH3CN做还原剂时，多数反应要控制pH 值在68，先生成亚胺离子,且产品及后处理的废液中总是含有少量的有毒物质氰化物存在。而且NaH、CH3I和Ag2O 价格较昂贵，硫酸二甲酯具有很强的毒性，有些反应需要形成噁唑烷酮中间体，有些反应只能引进芳基。鉴于此，本实验研究苏氨酸的N,N-二甲基化过程采取还原胺化法，将苏氨酸与无毒多聚甲醛反应后用甲酸还原，直接得到N,N-二甲基化的苏氨酸。不仅获得较高的产率，且实验条件温和无毒，反应时间短，符合绿色化学的理念。由于pH 响应高分子材料是研究的最为广泛的一类环境响应高分子材料22，因而也是本实验最关注的后期合成。本实验的目的在于进一步合成具有生物相容性的可降解pH敏感聚合物，生成的烷基化产物可以继续进行超支化反应，形成超分子聚合物体系，例如可以继续和乳酸及氮异丙基丙烯酰胺反应制得多重敏感聚合物。第二部分 实验部分1.仪器与试剂1.1 仪器FT-IR: Nicolet AVATAM 360 FT-IR 红外分光光度计，4000-400 cm-1 范围摄谱雷磁 pHS-25 数量pH 计NMR：400MHz旋转蒸发仪(GKLPM-L053)1.2 试剂L-苏氨酸（98%）：上海晶纯试剂有限公司多聚甲醛（分析纯）：天津化学试剂有限公司甲酸（分析纯）：天津化学试剂有限公司无水乙醇（分析纯）：天津化学试剂有限公司2. N,N-二甲基苏氨酸的合成方法称取苏氨酸0.01mol（1.19g），并依次加入多聚甲醛0.03mol(0.9g),甲酸0.05mol(2.3g),抽真空H2循环三次，1000C回流5h，之后升温至1200C继续回流30min，得到白色黏稠状液体。将该白色黏稠状液体在设定温度下减压蒸馏10h，以除去过量的反应物。将减压蒸馏后的白色黏稠液体加热并用无水乙醇溶解，往其中滴加氢氧化钠的乙醇溶液，边滴加边摇匀溶液至pH=6.16时停止。此时溶液中有大量白色沉淀产生。静置并过滤白色沉淀，取滤液。再将滤液用旋转蒸发仪旋转蒸干即得目标产物N,N-二甲基苏氨酸。结果与讨论1.苏氨酸N烷基化的反应机理在过量甲酸存在下，甲醛与一级胺或二级胺反应，生成N-甲基化的胺，这个反应称为埃斯韦勒-克拉克反应。反应机理如下式所示，甲醛与胺生成亚胺，其中甲酸作为还原剂，是氢的供体，提供氢离子进行还原。总反应： 2.实验条件的优化本实验从原料用量比、反应环境的pH及其他实验条件改变的角度出发进行实验的优化。从下表(表格1，表格2，表格3)可以看出，当原料比n(Thr):n(HCHO):n(HCOOH)=1:3:5，pH=6-7，反应时间为5h，采用多聚甲醛和H2, Pd/C进行反应时，可以获得较高产率。但由于Pd/C较昂贵，故本实验采取甲酸做反应物并依据此最佳反应条件进行。表 1 反应物用量比对产物产率的影响Table 1The ratio of raw material afffect on the yield of productsn(Thr)/n(HCHO)/n(HCOOH)产率 %1.0 :2.0 :5.040.11.0 :2.2 :5.045.61.0 :2.4 :5.050.31.0 :2.6 :5.052.41.0 :2.8 :5.057.61.0 :3.0 :5.060.81.0 :3.2 :5.056.91.0 :3.4 :5.053.2表 2不同pH值对产物产率的影响Table 2 Different pH value afffect on the yield of productspH值反应液状态产率 %2黄色透明溶液未检出3黄色透明溶液未检出4黄色透明溶液未检出5黄色透明溶液30.76黄色透明溶液58.27黄色透明溶液65.48分层，下层为白色溶液液50.59分层，下层为白色溶液29.8表 3 其他实验条件的优化Table 3 Other experimentatl conditionsoptimization优 化 条 件反应时间优化还原剂的优化甲基化试剂的优化1 h5 h10 h甲酸草酸H2, Pd/C甲醛多聚甲醛产率46%60%40%60%-85%60%60%3.红外分析（FT-IR）对合成的N,N-二甲基苏氨酸进行了结构表征，图中将苏氨酸的红外光谱图与N,N-二甲基苏氨酸的红外光谱图进行比较（谱图1）。图 1. N,N-二甲基苏氨酸与苏氨酸的红外光谱图Figure 1. FT-IR of N,N-dimethyl-threonine and threonine由以上红外谱图可以明显看出：苏氨酸的O-H 的伸缩振动在3500-3400cm-1，在3200cm-1 处为N-H 伸缩振动，N,N-二甲基苏氨酸在3100 -2800cm-1 处有-CH3 的C-H 伸缩振动。在倍频区2050cm-1 处,苏氨酸有一个不太强却十分明显的吸收峰, 为N-H 的摇摆振动，而N,N-二甲基苏氨酸没有。在1400-1300 cm-1 处苏氨酸只有一个对称变形振动峰，而N 甲基化的苏氨酸由于两个甲基的对称变形振动互相偶合使吸收带发生分裂，出现两个峰。苏氨酸在3204-2400cm-1 区间有一宽而强的NH3+伸缩振动谱带。在1567-1456 cm-1 有NH3+的两组吸收峰, 分别为不对称弯曲和对称弯曲振动，而N 甲基化的苏氨酸则没有，但在1465 cm-1 处有C-N 伸缩振动峰。4.核磁共振（NMR）谱图分析对合成的N,N-二甲基苏氨酸进行了结构表征，下图中为N,N-二甲基苏氨酸的核磁共振（NMR）谱图（谱图2，谱图3）。 图 2. N,N-二甲基苏氨酸的1H-NMRFigure 2. 1H-NMR of N,N-dimethyl-threonine由图2可以明显看出：在=2.7ppm 处的单峰Hd 是N上的两个-CH3的质子峰；=3.2-3.3 ppm 处的双峰归属于羧基邻位-CH-的质子峰，因受吸电子基-COO-的影响,显著移向低场；=3.9 ppm 处的多重峰归属于与-OH相连的-CH-的质子峰。 图3. N,N-二甲基苏氨酸的13C-NMR Figure 3. 13C-NMR of N,N-dimethyl-threonine结论不同结构的氨基酸具有不同的生物效应，而不同的N烷基化的氨基酸不仅具有各异的生物效应，由其构成的多肽和蛋白质也显出不同的生物效应，如抗菌，抗病毒，抗癌等。这样合成不同烷基化的氨基酸的方法也会多种多样。烷基化氨基酸的合成将是一个热点，它们将在医学上显示出重大的医用前景，发挥出重要功效。但是寻求催化范围更广和具有更高的催化效率的催化剂，寻求更好的催化体系，寻求温和的反应条件、低毒性环境和广泛适用于某一类反应的方法是我们需要考虑的。我们也有必要考虑简化实验操作，缩短反应时间，降低实验成本这些问题。同时我们仍要考虑回收问题，环境污染问题以及产物的降解问题以实现绿色化学。利用环境响应材料去构筑具有特殊形貌和结构的高分子材料是目前的热点之一。其中，聚合物中空结构，由于其具有特殊的内部空间，具有容纳客体分子的能力，在许多领域，如药物的控制释放，蛋白质、酶、DNA等活性大分子的包覆，水处理以及催化等，有重要的应用前景。参考文献1 Chaire, M. M.; Douglas, W. Y. J . Chem. Soc. Perkin. Trans, 1997, 23, 3519-3521.2 钟益宁, 崔建国. 化工技术与开发, 2007, 36, (4), 15-22.3 Thomas, R.; Benoit, D.; Francis, H.; et al. J. Peptide Sci, 1999, 5, 56-58.4 Alessandro, M.; Marco, C.; Bernard, K.; et al. Biopolymers (Peptide Science), 2006, 84, 553565. 5 Roberto, C.; Giovanna, G. F.; Marisa, B. F.; et al. Tetrahedron: Asymmdry, 1992, 3, (3), 387-400.6 Mr M.; gmundur, V. R.; Jukka, H.; et al. J. Eur. Poly., 2007, 43, 26602671.7 布晓东, 许艳杰. 科技与开发, 2008, (4), 1-5.8 Olsen, R. K. 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