理工大学生物化学实验教材(全20120705).doc

生物化学实验北京理工大学生命学院生物化学实验教材编写组29生物化学实验室规则1 实验前必须认真预习实验内容，了解实验的目的、基本原理和操作方法。准备好白大褂，实验讲义、油性记号笔、记录本、笔等。2 实验室中应严格遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声喧哗，严禁吸烟、吃食物。3 第一次实验前各组应按实验器材清单清点实验器材；每一次完成实验后清洗仪器，清理桌面，经老师同意后，方可离开；最后一次实验完毕后，应在清点完实验器材，填写完清单后发方可离开。4 实验过程中，必须穿白大褂。要保持实验台面仪器、药品、试剂排放整齐。要节约使用药品、试剂，避免漏洒，如有发生应及时处理。5 要爱护公物，公用仪器及药品用完后要放回原处，尽量避免损坏仪器和玻璃器皿，如有损坏，应填写破损单，注明原因，并按原价赔偿。损坏的玻璃器皿及废针头应放到老师指定位置。实验完毕，须核对柜内器物无误方能离开。6 实验过程中严格按操作规程进行实验，认真、及时、如实记录实验结果。7 实验报告需写出班级、学号、姓名，实验目的，实验原理，试验内容，实验材料，实验现象，结果与讨论、思考题等（详见“生物化学实验课程内容及要求”中的“一、实验报告要求”）。8 学生轮流值日，由各班班长按老师要求根据学号安排，实验前10分钟到实验室，协助实验课前事项，包括公用仪器的检查、公用试剂的整理、试剂添加、器皿清洗。实验完毕，做好实验室环境卫生，负责实验室的窗台、讲台、桌面、地面、水池、药品架等的清洁，倾倒垃圾箱中的废物，水浴锅将水排放干净，凳子排放整齐，柜子锁好，检查门、窗、水、火、电、气是否关闭。10. 成绩评定：实验报告占60%，实验表现占30%，不管何种原因，未上实验课，实验表现0分，出勤5%（缺席一次扣5%，请事假和病假一次扣3%，请公假不扣分，迟到扣1%，）和卫生5%。实验报告抄袭按不及格处理。生物化学实验课程内容及要求一、实验报告要求除电脑作图、照片外，其他内容要求手写在学校统一的实验报告纸上，各位同学之间的实验报告内容不能抄袭、雷同，否则视程度不同，以不及格论处。具体要求如下：实验题目1 实验目的 2 实验原理要求理论清晰、概括性强。必须查阅相关文献资料，对相关的基础理论知识、实验方法现状及各种实验方法的比较。 3 实验材料与试剂(1)实验器材 (2)实验试剂4 实验方法要求列出实验操作注意事项，包括步骤操作注意事项及试剂、仪器安全操作注意事项5 结果与分析包括现象描述、数据、结果计算及相关图表、照片等，然后对实验结果、数据作出分析、讨论。6 思考题分析7 参考文献1 Kiepiela P, Leslie A J, Honeyborne I, et al. Dominant influence of HLA-B in mediating the potential co-evolution of HIV and HLA. Nature, 2004, 432: 769-7752 孙玉英, 孔繁华, 奚永志等. HLA-I类PCR-SSP基因分型在异基因造血干细胞移植中的应用. 中华器官移植杂志, 2001, 22(6): 326-3283 Lee J, Pillai S. Complete nucleotide sequence of MHC class I alleles in the HT29 colon cancer cell line. Tissue Antigens, 1993, 42: 530-5324 谭建明, 周永昌, 唐孝达主编. 组织配型技术与临床应用. 第1版. 北京: 人民卫生出版社, 2002. 621318 原始实验记录：每位同学需将实验课上记录的数据或现象附在报告后面。注意，“原始实验记录”是指包括实验中主要实验内容及其有关数据在内的原初记录，不只是测试数据的记录。以上1-4项为预习报告内容，需在上实验课之前完成；5-8项为上完实验课后完成的内容。在下一次实验课之前将1-8项完整的实验报告交班长再统一交给老师。二、预习要求：实验课前必须预习。实验报告中1-4项实验目的、实验原理、实验材料与试剂、实验方法为预习报告内容，首先要完全看懂实验讲义；其次要多查各种参考资料，包括理论教材、实验教程、期刊文献，在实验原理和实验方法中对相关的实验方法进行比较，对实验原理进行分析，对实验讲义中的难点进行注释和讨论，充分体现学生对实验内容的理解。每节实验课上检查预习情况，计入成绩。三、实验小组划分：按学号分组：一般两人一组。四、实验上课时间 实验室安全守则在实验室内必须树立“安全为了实验，实验必须安全”的思想。化学实验经常会用到易燃、易爆溶剂，如甲醇、乙醇、乙醚等。有些溶剂还有毒性，如苯、氯仿等。有些有机酸、碱具有腐蚀性。这些物质都有可能给实验人员带来意外伤害，实验操作过程中必须树立安全第一的思想，绝不能马虎大意。一旦草率操作，发生事故，轻则损伤衣服、皮肤，重则着火爆炸，即影响人身安全又损坏公物，严重者还要追究责任。为避免发生事故，必须了解预防和处理事故的一般常识。一、事故和预防1. 实验前必须细心检查玻璃仪器是否有裂缝、破损等，实验装置必须安全、稳当，严格遵守操作规程。2. 严禁在实验室内吸烟。易燃、易爆的有机溶剂必须远离火源、电源。多余的或实验用后的有机溶剂应倒入废物瓶或指定容器内，切勿倒入水池里。3. 严禁在实验室内吃食物。实验过程中会出现有毒或有腐蚀性气体的操作，应在通风橱内进行。4. 实验室必须穿实验服，以免酸碱腐蚀衣物。二、事故的处理与急救1. 火灾(1)一旦发生火灾，应保持沉静，不要惊慌失措，首先应立即熄灭火源，并转移附近的易燃物质。(2)小溶剂（即毫升）着火，可用湿布盖熄，稍大的火焰可用黄沙或湿拖把盖灭。有机溶剂着火绝对不能用水浇，因为这样反而会使火焰蔓延开来。(3)若衣物着火，且勿奔跑，用厚的外衣包裹熄灭，较严重者应躺在地上滚动（以防火焰烧向头部），用自来水冲淋熄灭。(4)发生大火，应先用灭火器扑灭，不论何种灭火器，皆应自火的四周向中心扑灭。在尽力救火的同时向“119”报警。(5)严重受伤者应立即送医院治疗实验室常见灭火器如下：四氧化碳灭火器：用以扑灭电器内或电器附近之火。因CCl4本身有毒，且在高温下生成光气（剧毒），故不能在不通风的实验室内使用四氧化碳灭火器。二氧化碳灭火器：化学实验室常用灭火器，用以扑灭电器火灾，注意，由于使用的是压缩的CO2，液体不要喷在手掌上，以免温度骤降造成手部冻伤。泡沫灭火器：其内分别装有NaHCO3溶液和硫酸铝溶液，使用时将同时颠倒，两种溶液反应生成NaHSO4、Al(OH)3及大量CO2，所以灭火机制仍然是CO2泡沫，因为后处理麻烦，故一般在大火时使用。2. 玻璃割伤玻璃割伤是实验室常见事故。如为一般轻伤，应用消毒过的镊子取出玻璃碎片，及时挤出污血，用蒸馏水洗涤伤口，涂上红药水和碘酒后包扎好。如为大伤口，应立即用绷带扎紧伤口上部，使伤口停止出血，立即送往医院救治。3. 烫伤切忌用自来水冲洗。轻伤涂甘油或硼酸凡士林，重伤应先涂烫伤膏，后立即送医院。4. 试剂灼伤(1)酸液或碱液灼伤皮肤时，若为酸液灼伤，首先用大量水冲洗伤处，再用5%碳酸氢钠溶液洗涤；若为碱液灼伤，首先用大量水冲洗伤处，再用1%醋酸洗涤。最后再用水洗，涂上油膏凡士林。(2)碱液或酸液溅入眼睛时，抹去溅在眼睛外面的酸液或碱液，立即使用喷淋器用大量水冲洗。快速送往医院治疗，不允许用其他试剂进行中和。(3)酸液或碱液洒在衣服上，先用水冲洗。若为酸液再用氨水洗。若是碱液，再用10% 醋酸溶液洗涤，然后用氢氧化铵中和多余的醋酸，最后用水洗涤。(4)酸液洒在地上，先撒石灰粉，再用水冲洗。 5. 中毒如有毒物质进入口中，首先应用大量清水漱口。饮用大量清水后，用手指深入咽喉处，人为促使呕吐（若是腐蚀剂中毒则不能用此法，可服用牛奶、蛋清或植物油等），然后立即送医院治疗。若吸入有毒气体，应立即到室外呼吸新鲜空气，必要时送医院治疗。6. 触电遇到触电发生，首先要拉开电闸以切断电源，并尽快用绝缘物（干燥木棒、竹竿、有机玻璃、橡胶棒、塑料棒等）将触电者与电源隔离，必要时进行人工呼吸，并报“120”迅速送医院救治。事故发生不仅会导致实验失败，而且会造成公共财物的损坏和实验人员身体的损伤。在实验室和工作过程中，要时时处处小心，只有严格按照操作流程进行操作，并保持实验秩序良好，才能消除事故隐患，防患于未然！目 录生物化学实验1实验一 糖和蛋白质的理化性质检验1实验二 酵母RNA提取与含量测定13实验三 果蔬中维生素C的定量测定（紫外法）18实验四 植物叶片过氧化脂质的提取与测定21实验五 蛋白质的定量测定(考马斯亮蓝法)24实验六 蛋白质的定量测定（凯氏定氮法）26实验七 淀粉酶动力学分析（）30实验八 淀粉酶动力学分析（）40生物化学实验48实验一 酶联免疫吸附试验48实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量51实验三 CM-纤维素离子交换层析柱法分离卵清蛋白组分56实验四 枯草杆菌蛋白酶活测定59实验五 氨基酸的纸层析63教材、参考书66生物化学实验实验一 糖和蛋白质的理化性质检验（4学时）第一部分 蛋白质的理化性质第一节 蛋白质的颜色反应一、实验目的 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。 二、实验原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 三、实验器材与试剂 实验器材 1. 鸡蛋1个2. 吸管1.0mL（1）3. 试管 .5cm15cm（2）4. 试管架5. 试管夹2个6. PH试纸（5-7）7. 水浴锅实验试剂 1.卵清蛋白液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，离心，上清液冷藏备用。2.1%茚三酮溶液： 1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。3.浓硝酸： 比重1.42。 4.10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL。 四、实验方法 A. 黄色反应 蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较难硝化，需用浓硫酸促进之。反应如下：操作方法：于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴，加热，冷却后再加10NaOH溶液20滴，观察颜色变化。 B. 茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。操作方法：取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意：此反应必须在pH57进行。C.双缩脲反应（参考实验） 将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应（双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水解，及用比色法作蛋自质之定量测定）。其反应式如下：操作方法：1.取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出之氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10NaOH溶液1mL摇匀，再加2滴1硫酸铜溶液，混匀，观察有无紫色出现。2.另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10NaOH溶液10滴及硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用，生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42，妨碍此颜色反应的观察。 第二节 蛋白质的沉淀反应一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应。2.进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、实验原理多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构改变很小或基本没有改变，仍然保持原来的生物活性，只要消除沉淀因素，沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。不可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失后，沉淀也不会重新溶解。三、实验器材与试剂 实验器材1.试管 1.5cm15cm（5）。 2.吸管5.0L（2），2.0L（3），1.0L（1）。3.玻璃漏斗5cm 1个。4.滤纸9cm1张。实验试剂1.蛋白质试液：见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。2.硫酸铵晶体： 如颗粒太大，最好研碎。3.饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100L加硫酸铵至饱和（硫酸的饱和度：707g/1000mL）。4.95乙醇。5.结晶氯化钠。6.1%醋酸溶液：冰醋酸1L用蒸馏水稀释至100L。7.5鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100L。 四、实验方法 A. 蛋白质盐析作用 向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。操作方法： 1.取蛋白质溶液4mL，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50饱和），微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。分取一半混合液，加水观察沉淀是否溶解。2.将混合液的另一半过滤，滤液中加硫酸铵粉末（约0.8g），至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。注意：(1)应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；(2)固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。 B. 乙醇沉淀蛋白质 乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。操作方法：取蛋白质溶液1L，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95乙醇3mL混匀。观察有无沉淀析出。C. 生物碱试剂沉淀蛋白质 植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。 操作方法：取1支试管，加入2L蛋白质溶液及1醋酸溶液4-5滴，向一管中加5鞣酸溶液58滴，观察结果。D.重金属盐沉淀蛋白质（参考实验）蛋白质与重金属离子（如Cu2,Ag，g2等）结合成不溶性盐类而沉淀。操作方法：取试管2支各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加醋酸铅溶液，另一管内滴加 1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。第二部分 糖的理化性质第一节 糖的颜色反应A. 莫氏试验一、实验目的掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。 二、实验原理 糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与-萘酚生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。三、实验器材与试剂实验器材1.棉花或滤纸。2.吸管 1.0L（4）、 2.0L（1）。3.试管1.5cm15cm（4）。4.水浴锅实验试剂1.莫氏试剂： 称取-萘酚5g，溶于95乙醇并稀释至100L。 此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。 2.1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100L。3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100L。4.1%淀粉溶液：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物， 然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。5.浓硫酸 四、实验方法于4支试管中，分别加入1mL 1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1mL水中），然后各加莫氏试剂滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加人浓硫酸1.5mL（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。注意：1. 一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。2. 亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。3. 莫氏试剂应直接滴入试液中，勿使试剂接触试管壁，否则试剂会与硫酸接触生成绿色而掩盖紫色环 。B. 杜氏试验一、实验目的掌握杜氏（Tollen）试验鉴定戊糖的原理和方法。二、实验原理戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本试验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖特有反应。果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳性反应。戊糖反应最快，通常在45s内即产生红色沉淀。 三、实验器材与试剂实验器材1.吸管 1.0mL（1）2.试管 1.5cm15cm （3）3. 水浴锅。实验试剂1.杜氏试剂：1%间苯三酚乙醇溶液（2 g间苯三酚溶于100mL95乙醇中） 3mL，缓缓加入浓盐酸15mL及蒸馏水9mL即得，临用时配制。 2.1%阿拉伯糖溶液： 称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。3.1%葡萄糖溶液：见试验A。4.1%半乳糖溶液： 称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。四、实验方法于3支试管中各加入杜氏试剂1mL，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。各试管同时放入沸水浴中，观察颜色变化并记录颜色变化时间。C. 塞氏试验 （参考实验）一、实验目的掌握塞氏(Seliwanoff)试验鉴定酮糖的原理和方法。二、实验原理酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5一羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应； 有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。以糖为例，其反应如下。三、实验器材与试剂实验器材1.移液管 0.5mL（3），5.0mL（1）2.试管1.5cm15 cm（3）。3.水浴锅。实验试剂1.塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100mL盐酸中（V（H2O）:V（HCl）2:1），临用时配制。 2.1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。3.1%葡萄糖溶液：见试验A。4.1%蔗糖溶液：见试验A。四、实验方法于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、 1%蔗糖溶液和 1%果糖溶液各0.5mL，各加塞氏试剂2.5mL，摇匀，同时置沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。注意：在此实验条件下，蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖，而呈阳性反应。葡萄糖与麦芽糖亦呈阳性反应，但呈色反应的速度较酮糖缓慢。果糖的红色出现及沉淀的产生，应在加热后20-30s内，生成的沉淀能溶于乙醇并成红色溶液。第二节 糖的还原作用一、实验目的掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。二、实验原理费林（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）试剂均为含Cu2的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O（由于沉淀速度不同，形成的颗粒大小不同，颗粒大的为红色，小的为黄色。）此法常用作还原糖的定性或定量测定。 其反应表示如下： 目前临床上多用本尼迪特法，此法具有如下优点：试剂稳定，不需临用时配制；不因氯仿的存在而被干扰；肌酐或肌酸等物质所产生的干扰程度远较费林试剂小。 三、实验器材与试剂实验器材1.移液管 1.0mL（3）、 2.0mL（）。2.试管1.5cm15cm （3）。3.水浴锅。4.试管架。实验试剂1.本尼迪特试剂： 称取 85g柠檬酸钠 （Na3C6H3O711H2O）及50g无水碳酸钠，溶解于400mL蒸馏水中。另溶解8.5g硫酸铜于50mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。2.费林试剂 （参考实验）试剂A：称取硫酸铜（CuSO45H2O）34.5g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。试剂B：称取氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。临用时将试剂A与试剂B等体积混合。3.1淀粉溶液：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。4.1蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。5.1葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。四、实验方法取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL， 然后每管加本尼迪特试剂2mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。 另于3支试管中加人费林试剂A和B各mL，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化（此为参考实验，本实验不做）。五、实验报告1.内容与要求：实验目的、实验原理、主要实验仪器设备与试剂、实验步骤、实验现象、结果分析与讨论。2.思考题（1）双缩脲、茚三酮、黄色反应适用鉴别的对象是什么？（2）什么叫蛋白质的变性？盐、乙醇、重金属、生物碱沉淀蛋白质反应哪些是可逆反应，哪些是不可逆反应？（3）莫氏、塞氏、杜氏颜色反应适于鉴别哪类糖？ （4）比较斐林和本尼迪特试剂法有何异同？实验二 酵母RNA提取与含量测定（4学时）一、实验目的1.了解实验室及工业提取RNA的常用方法。2.了解有关RNA实验的过程中必须注意的事项。3.掌握稀碱法提取RNA及紫外分光光度法测定RNA含量的基本原理和具体方法。二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而RNA的提取制备方法也各异。一般实验室提取制备RNA的方法有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的，组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。 工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性RNA，主要用作制备核苷酸原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10左右氯化钠溶液，90提取34h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱（本实验用0.2NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀或调pH 2.5利用等电点沉淀RNA。酵母含RNA达2.6710.0%，而DNA含量仅为0.030.516，因此提取RNA多以酵母为原料。RNA含量测定，常用紫外吸收分光光度法、定磷法和地衣酚（3,5-二羟基甲苯）法。本实验采用紫外分光光度法。紫外分光光度法测定原理：核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处。一般在260nm波长下，每1ml含1gRNA溶液的光吸收值为0.0220.024，每1ml含1gDNA溶液的光吸收值为0.020，故测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测光误差较大，故应设法事先除去。定磷法测定原理：元素分析表明，RNA平均含磷量为9.4%，DNA平均含磷量为9.9%，因此可以通过测定核酸样品的含磷量计算RNA或DNA的含量。用强酸将核酸样品消化，使分子中的有机磷转变为无机磷酸，无机磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，磷钼酸在还原剂（如氯化亚铁、抗坏血酸等）作用下还原为钼蓝。钼蓝的=660nm，在一定浓度范围内，溶液的吸收值和无机磷酸的含量成正比。该法测得的磷含量，减去无机磷的含量才是核酸的含磷量。地衣酚法测定原理：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3,5-二羟基甲苯（地衣酚orcinol）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm有最大吸收。RNA浓度在10100gmL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应， DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此，测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。三、实验器材与试剂实验仪器0.01电子天平、电热恒温水浴锅、低速大容量普通离心机、循环水真空泵、紫外分光光度仪实验器材1.100 mL烧杯1个2.50 mL量筒2个3.10 mL量筒2个4.玻璃棒2个5.容量瓶50 mL2个6.吸管1 mL和2 mL各1个7.长头滴管2个8.布氏漏斗1个（内径7.5cm，外径8.5cm）9.7cm慢速分析滤纸10.500 mL抽滤瓶1个11.抽滤垫1个12.试管夹2个13. pH试纸（28）实验材料市售干酵母粉4g。实验试剂1.0.2NaOH溶液，6g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至3000ml2.6mol/L盐酸溶液 （400 mL）3.浓盐酸2瓶4.乙酸3瓶595%乙醇6瓶。（3000mL）四、实验方法酵母RNA提取1.称取4 g干酵母粉置于100 mL烧杯中。2.加入40 mL 0.2NaOH溶液，沸水浴上加热30 min，经常搅拌。3.冷却，加入数滴乙酸使提取液呈酸性（PH56）。4.离心1015min（4000 r/min），取上清液，加入30 mL95%乙醇，边加边搅动。（或用6mol/L盐酸调至RNA等电点pH = 2.5）。5.加毕，静置，待RNA沉淀完全后，布氏漏斗抽滤（注意：过滤前一定先将布氏漏斗连同滤纸称重，滤纸直径既要小于漏斗内径，又要能盖住漏斗漏孔；过滤及下一步洗涤过程中，不能带水，否则沉淀会粘在滤纸上无法取下；）。6.滤渣先用95乙醇洗两次，每次用10 mL。再用无水乙醚洗两次，每次10 mL，洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。7.最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品重量(M) 。8.计算：干酵母粉RNA得率（）1 00紫外吸收法测定RNA含量1.称量本实验自制干燥RNA粗制品10mg（N）置于100ml容量瓶中。2.加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量水稀释。3.用0.2NaOH溶液调PH7加蒸馏水定容到100 mL。 4.于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算RNA浓度。计算公式：RNA浓度（g/ml）=式中A260：260nm波长处光吸收读数干酵母粉RNA含量（）=100%式中 M：RNA粗品的总重量，N：实际称量RNA粗品重量五、注意事项1.实验过程中加试剂沉淀时应边加边搅拌，以免局部过浓影响实验结果。2.在抽滤前务必将漏斗和滤纸一并称重，RNA粗品重量为减掉漏斗和滤纸的差重。3.为了提高RNA干燥过程中的效率，抽气过程中应尽量避免各接口漏气。六、实验报告1.内容与要求：实验目的、实验原理、主要实验仪器设备与试剂、主要实验步骤与现象观察、含量计算、结果分析与讨论。2.思考题（1）RNA提取中，经处理的酵母菌为什么水浴加热？为什么要将提取液调至酸性？（2）在RNA提取中，滤渣为什么先用95乙醇洗，再用无水乙醚洗？（3）紫外吸收发法测定核酸含量的基本原理是什么？有何优点及缺点？实验三 果蔬中维生素C的定量测定（紫外法）（4学时）一、实验目的1. 学习用铜离子氧化法测定维生素C（Vc）（紫外法）；2. 了解Vc定量测定的其他方法，如：磷钼酸比色法、碘量法、2,6-二氯酚靛酚滴定法（近年来用全自动电位滴定仪进行电位滴定）、紫外法、2,4-二硝基苯肼测定总抗坏血酸量、高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光法、Flinb近红外分光光度法等。二、实验原理抗坏血酸在波长243267nm处有较高的吸收值，但在样品成分比较复杂时，因有强烈的背景吸收而不适宜用紫外法测定其Vc含量。用碱加热法等处理法都存在试剂较贵、操作复杂、时问长等一系列问题而不能广泛应用。利用铜离子消除背景误差，能直接测定一些水果蔬菜样品中的Vc含量而不需要进行前处理，操作简单干扰少。附加说明：在测定Vc的国标方法中，荧光法为测定食物中Vc含量的第一标准方法，2,4-二硝基苯肼法作为第二法。三、实验器材与试剂实验材料桔子实验器材紫外/可见分光光度计；涡旋混合仪；高速冷冻离心机；榨汁器；电热恒温水浴锅；试管与试管架；胶头器长滴管及移液管；250mL烧杯等。实验试剂1. 120g/mL Vc贮液：120mg Vc，加适量蒸馏水溶解，然后用1000毫升容量瓶定容。存4备用。2. 5g/mL的铜离子溶液：先配成1000g/mL的硫酸铜溶液；取上述硫酸铜溶液5mL，加入1mol/L的醋酸溶液7mL及1mol/L醋酸钠200mL，用蒸馏水定容。5104mol/L的EDTA溶液：36.5mgEDTA溶于适量蒸馏水，250 mL馏水定容。铜离子-EDTA混合液（6.2105mol/L）：使用前将上述铜离子溶液和EDTA以4:1（v/v）混合而成（现用现配）。四、实验步骤1. 标准曲线制作取12支试管（大试管）分成2组，按下表进行操作。维生素C溶液浓度为120g/mL。蒸馏水(mL)1.00.90.80.70.60.5标准Vc(mL)00.10.20.30.40.5Cu2+-EDTA（pH6）5.05.05.05.05.05.0A267浓度(g/mL)2. 样品测试取一定量的桔子瓣记录克数。挤压成汁，9000 rpm，4离心15min，取上清液量其体积并稀释20倍。1 mL样品稀释液，加入5mL铜离子-EDTA混合液（pH6）于波长267nm处测定其吸收值，结果为J（I）。取1mL样品稀释液加入4mL铜离子溶液（5g/mL），50水浴中加热15min，以破坏所有Vc，然后加入1mL 5104 mol/LEDTA溶液于波长267nm处测定其吸收值，结果为J（II）。3. 计算样品中Vc含量 = 其中：6铜离子-EDTA溶液稀释倍数JJ(I )-J(II)V材料总体积S标准曲线斜率M样品质量五、注意事项由于Vc已被氧化，同时不同植物体内不同程度地含有已被氧化成深色产物的鞣酸等成分，为尽量避免背景物质、有色物质的产生，准确测定Vc含量，实验过程中应尽量迅速操作。六、实验报告1. 内容与要求实验目的与要求、实验原理、主要实验步骤与结果观察、结果与讨论。2. 思考题查阅、比较与讨论目前测定Vc的方法，谈谈自己的看法。实验四 植物叶片过氧化脂质的提取与测定（4学时）一、实验目的1. 了解过氧化脂质含量测定的重要意义；2. 掌握脂质过氧化作用的最常规、最成熟的分析方法硫代巴比妥酸（TBA）法。二、实验原理植物组织的衰老总是伴随着细胞内膜结构的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗出来。很多研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞（特别是线粒体或叶绿体）中产生的超氧阴离子自由基O2和羟基自由基OH诱导膜质中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化作用，产生脂质自由基。它不仅能连续诱发脂质的过氧化作用，而且又可使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，从而使细胞质膜变性，最终导致细胞损伤或死亡。脂质过氧化作用的分析方法有多种，其中最常规、最成熟的方法是硫代巴比妥酸（TBA）试验。在脂质过氧化作用中产生的丙二醛，可与硫代巴比妥酸形成红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），在532 nm处有一吸收峰，根据其在532 nm处的吸收系数可计算出细胞中丙二醛的含量。丙二醛含量的多少可代表膜损伤程度的大小。醛、单糖对此反应有干扰，溶液的pH值和温度对反应也有影响。TBA方法的特点是灵敏、简便、重复性好，适用于多种形式的生物样品的测定。三、实验器材与试剂实验材料富贵竹叶片。实验仪器研钵、剪刀、镊子、水浴锅、试管、紫外可见分光光度计、离心机、天平。实验试剂0.5%硫代巴比妥酸（溶于20%三氯醋酸中）溶液。四、实验方法1. 分别摘取富贵竹植株上不同叶位的叶片数片，将同一叶位的叶片放在一起，洗净擦干，剪成0.5 cm长的小段。2. 称取每一叶位的叶片切段各0.3 g，分别放入研钵中，加入少许石英砂和2 mL蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用3 mL蒸馏水分两次冲洗研钵，合并提取液。每一叶位的材料各做两个重复实验样品。3. 在提取液中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。4. 将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），之后立即将试管取出并放入冷水浴中。5. 待试管内溶液冷却后，以3000 r/min的转速离心15 min，取上清液并量其体积。以0.5%硫代巴比妥酸溶液加上5 mL蒸馏水作为空白，测定532 nm和600 nm处的吸光度。6. 结果计算：根据下式计算叶片中过氧化脂质的含量：式中：V-上清液总体积；155-1 mmol三甲川在532nm处的摩尔吸收系数；W为称取植物材料的鲜重（g）。五、注意事项摘取植株远距离的不同叶位的叶片数片，剪碎，混合，然后进行处理测定。六、实验报告1. 内容与要求：实验目的与要求、实验原理、主要实验步骤与结果观察、结果与讨论。结果与讨论：以不同叶位叶片中过氧化脂质的含量为纵坐标、叶位号为横坐标作图，说明叶片中过氧化脂质含量与叶位的关系。2. 思考题哪些因素影响膜的完整程度？试说明膜的完整程度与细胞衰老的关系。实验五 蛋白质的定量测定(考马斯亮蓝法)（4学时）一、实验目的学习考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法。通过检测添加三聚氰胺的样品的实际蛋白质的含量，掌握考马斯亮蓝法定量检测蛋白质的原理及特点。二、实验原理考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式，红色和蓝色。在非结合状态下为红色，当通过范德华力与蛋白质结合后，颜色会变为蓝色，最大吸收波长由465 nm变成595 nm。吸光度的变化与蛋白质浓度的关系符合比尔定律。蛋白质与染料的结合在2 min即可完成，达到最大光吸收。1 h后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀。考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质的灵敏度很高，标准测定法的灵敏度是Lowry蛋白测定法的4倍，其测定范围为10-100g，微量法的测定范围为1-10g。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲。相比Lowry蛋白测定法，考马斯亮蓝法测定快速、简便，干扰物质少。三、实验器材与试剂实验仪器试管及试管架，移液管（0.1 mL 5mL），分光光度计。实验试剂1. 考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL95%乙醇中，加入100 mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含有0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。2. 标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量（可直接根据产品标定的蛋白质含量确定），根据其纯度用0.15 mol/L NaCl配制成0.1 mg/mL的蛋白溶液。3. 测试样品样品1：同凯氏定氮法检测样品（牛血清白蛋白+三聚氰胺）：配制成0.05 mg/mL的溶液。（称量4.2308mg牛血清白蛋白及0.7692mg三聚氰胺，用0.15 mol/L NaCl定容溶解至100mL，供全班用）样品2： 牛血清白蛋白，0.05mg/mL的蛋白溶液。四、实验方法采用微量法测定。1. 取12支试管，分两组按下表平行操作。试管编号012345标准蛋白含量（mg/mL）00.010.030.050.070.090.1mg/mL标准蛋白溶液（mL）00.050.150.250.350.450.15 mol/L NaCl （mL）0.500.450.350.250.150.05考马斯亮蓝试剂 （mL）555555摇匀，1 h内以0号管为空白对照，595 nm比色。2. 以标准蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线，或通过Microsoft Excel线性回归求方程。 3. 样品用0.15 mol/L NaCl配制成0.05 mg/mL的溶液，用吸管吸取0.5 mL样品溶液，加入5 mL考马氏亮蓝试剂，以标准曲线制作中0号管作对照，测定OD值，平行做两份。求平均OD值，代入上述回归的线性方程，根据样品稀释度求得蛋白质含量。五、注意事项：考马氏亮蓝染色后，比色应该在2min-1h内完成，在严格测定的情况下，可在加入试剂后5-20min内测定OD,在这段时间内颜色最稳定。 实验六 蛋白质的定量测定（凯氏定氮法）（4学时）一、实验目的学习凯氏定氮法测定总氮含量的方法。通过检测添加三聚氰胺的样品的表观蛋白及实际蛋白质的含量，掌握凯氏定氮法定量检测蛋白质的原理及特点。二、实验原理食品制作需要检测蛋白质含量，但是直接测量蛋白质含量技术上比较复杂，成本比较高，不适合大范围推广，所以业界常常使用“凯氏定氮法（Kjeldahl method）”的方法，通过食品中氮原子的含量来间接推算蛋白质的含量。也就是说，食品中氮原子含量越高，蛋白质含量就越高。一种化工原料三聚氰胺，因含氮量很高、生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大的利益驱动，所以为了“增加”产品的表观蛋白质含量，出现了非法添加三聚氰胺的诸多案例。凯氏定氮法是测量天然有机物（蛋白质、核酸、氨基酸等）含氮量的常用方法。植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氨化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。可加入三氯乙酸，使其最终浓度为5，将蛋白质沉淀出来，分别测定总氮、蛋白氮或非蛋白氮。本实验对样品中总氮含量进行测定。要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变为无机氮后再进行测定。将待测样品与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。消化完成后，加入过量的NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。以甘氨酸为例，上述反应如下：CH2NH2COOH + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH32NH3 +H2SO4（NH4）2SO4（NH4）2SO4 + 2NaOH Na2SO4 +2H2O +2NH32NH3 +4H3BO3 （NH4）2B4O7 +5H2O（NH4）2B4O7 +2HCl +5H2O 2NH4Cl +4H3BO3 试样中若含有硝态氮时，首先要使硝态氮还原为铵态氮，可加入水杨酸和硫代硫酸钠，使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸，再用硫代硫酸钠（Na2S2O3）或Zn粉使硝基水杨酸转化为铵盐。由于水杨酸与硫代硫酸钠会消耗一部分硫酸，所以消化时的硫酸用量要酌情增加。三、实验器材与试剂实验材料牛血清白蛋白5.5mg、三聚氰胺1mg。实验仪器凯氏自动定氮仪，红外温控定时消化炉，玻璃消化管、三角瓶、酸式滴定管。实验试剂1. 浓硫酸（AR级）2. 35%NaOH 3. 混合催化剂：K2SO4：CuSO45H2O3：1，充分研细、混匀，贮于广口瓶中备用。4. 混合指示剂：取200mL 0.1%甲基红酒精溶液和50mL 0.1%甲烯蓝酒精溶液混合，贮于棕色瓶中备用。本指示剂在pH5.2时为紫红色，pH5.4时为暗灰或褐色，pH5.6时为绿色，变色点pH为5.4，变色范围为pH 5.25.6，非常灵敏。5. 2%硼酸溶液：按100：1的体积比加入混合指示剂，摇匀后溶液呈紫红色即可。6. 0.010 mol/L的标准盐酸溶液：取比重 l.19的分析纯盐酸0.84 mL，加无氨蒸馏水稀释至1L，再以硼酸钠标定。标定方法：精确称取四硼酸钠（Na2B4O