以适配体为识别试剂基于催化反应或荧光开关的蛋白质分析新方法.doc

以适配体为识别试剂基于催化反应或荧光开关的蛋白质分析新方法【摘要】：第一章：简要介绍了蛋白质检测的意义和方法、核酸适配体的定义以及适配体的诸多特性；从光学、电化学及其它检测技术出发,综述了基于适配体的蛋白质检测方法和研究进展；阐述了本论文的立题背景、主要研究内容及创新点。第二章：人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶,参与人体感染防御,炎症调节以及多种疾病的生理病理过程。我们以适配体作为识别配体,将HNE适配体分别固定在磁球或微孔板上来捕获HNE,被捕获富集的HNE特异性地催化多肽生色底物水解生成产物,利用吸光光度法测定生成的产物可实现对HNE的高灵敏定量检测。以磁球作为适配体固定基底,可以利用磁性分离的优势,以微孔板作为适配体固定基底则便于实现高通量快速分析。由于生色底物无色,而产物呈现肉眼可见的黄色,因此,无需使用任何仪器,通过简单的目视比色也可实现对HNE的半定量分析。所建立的方法结合了适配体捕获蛋白的特异性以及酶催化反应的特异性,因此,具有很高的选择性。检测方法还可以应用于血清中HNE的检测。第三章：基于适配体捕获和酶催化水解荧光底物,发展了一种更加灵敏的HNE检测方法。HNE首先被固定在磁球或微孔板上的适配体捕获,之后HNE催化水解荧光底物生成荧光产物。通过荧光光谱法检测产物可实现HNE的定量检测。分别采用磁球或微孔板作为适配体固定基底,以满足对操作简便性、分析灵敏度或者高通量检测等的不同分析需求。由于荧光分析的高灵敏度,因而本章方法所取得的灵敏度较第二章提高了近20倍。方法特异性良好,转铁蛋白、人血清白蛋白、人组织蛋白酶G、蛋白酶3、蛋白酶K、牛血红蛋白、胰蛋白酶、IgG、溶菌酶、猪胰弹性蛋白酶等蛋白或酶分子均不会对HNE的检测产生干扰。检测方法成功用于稀释人血清中游离HNE的检测,这表明所建立的方法适用于复杂样品的分析,在疾病诊断以及生物标识物检测方面具有应用前景。第四章：本章方法原理与第三章类似,基于适配体修饰的磁球,采用HNE的另一种新型特异的荧光底物(AAPV)2R110检测HNE,以扩大方法的应用范围。HNE被固定在磁球上的适配体捕获,磁性分离之后,加入荧光底物(AAPV)2R110,该底物经酶催化反应生成产物罗丹明,通过荧光检测产物,实现HNE的定量分析。由于该底物在缓冲液中的溶解性良好,可以使用较高浓度的底物,生成的产物也较多,检测范围较宽。催化反应完成后溶液呈现明显的亮黄色,因此本章中也可以采用简单的目视比色法实现HNE的半定量分析。与第三章方法类似,所建立的方法具有高灵敏度和高特异性。第五章：凝血酶是一种重要的丝氨酸蛋白酶,在血液中同时具有促凝和抗凝作用,常被作为某些疾病的生物标识物。基于激基缔合物(excimer)荧光开关适配体,建立了一种快速、简便、灵敏的凝血酶检测方法。含27个碱基的适配体末端分别用芘单体标记,凝血酶不存在时,仅能检测到两个荧光基团单体各自的发射峰(400nm附近),加入凝血酶后,两荧光基团靠近,并形成激基缔合物结构,在另一发射波长位置(485nm)产生新的发射峰。通过检测荧光基团缔合物的发射峰强度的变化可实现对凝血酶的定量检测,方法检出限42pM,且方法具有较好的特异性。由于芘单体荧光寿命约为5ns,而激基缔合物的荧光寿命可延长至40ns,因此可以利用时间分辨荧光技术,消除复杂样品中一些荧光物质的干扰,改善复杂样品中凝血酶的检测。【关键词】：适配体蛋白质催化反应荧光开关【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：O657;O629.7【目录】：目录4-9CONTENTS9-14中文摘要14-16ABSTRACT16-19第一章绪论19-411.1蛋白质检测的意义和方法191.2基于适配体的蛋白质检测方法研究进展19-291.2.1核酸适配体19-201.2.2基于适配体的蛋白质检测方法20-291.2.2.1光学方法检测蛋白质20-241.2.2.2电化学方法检测蛋白质24-281.2.2.3其它方法检测蛋白质281.2.2.4基于适配体的蛋白质检测方法研究进展28-291.3立体背景与主要研究内容29-301.3.1立题背景291.3.2主要研究内容29-301.4创新点30-31参考文献31-41第二章基于适配体捕获和生色底物催化水解的弹性蛋白酶分析法41-732.1引言41-422.2实验部分42-462.2.1仪器与试剂42-432.2.2采用适配体修饰的磁球检测HNE43-452.2.2.1适配体修饰的磁球的制备43-442.2.2.2酶催化反应条件的优化442.2.2.3HNE捕获条件的优化442.2.2.4HNE的检测44-452.2.2.5方法特异性考察452.2.2.6血清中HNE的检测452.2.3采用适配体修饰的微孔板检测HNE45-462.2.3.1适配体修饰的微孔板的制备452.2.3.2HNE的检测45-462.2.3.3方法特异性考察462.3结果与讨论46-672.3.1采用适配体修饰的磁球检测HNE46-632.3.1.1酶催化反应条件的优化46-512.3.1.2HNE捕获条件的优化51-552.3.1.3HNE的检测55-592.3.1.4方法特异性考察59-602.3.1.5血清中HNE的检测60-632.3.2利用适配体修饰的微孔板检测HNE63-662.3.2.1HNE的检测63-662.3.2.2方法特异性考察662.3.3HNE检测方法的比较66-672.4结论67参考文献67-73第三章基于适配体捕获和荧光底物(AAAA)_2-R110)催化水解的弹性蛋白酶分析法73-973.1引言733.2实验部分73-773.2.1仪器和试剂73-743.2.2采用适配体修饰的磁球检测HNE74-763.2.2.1适配体修饰的磁球的制备743.2.2.2酶催化反应条件的优化74-753.2.2.3HNE的检测753.2.2.4方法特异性考察75-763.2.2.5血清中HNE的检测763.2.3采用适配体修饰的微孔板检测HNE76-773.2.3.1适配体修饰的微孔板的制备763.2.3.2HNE的检测763.2.3.3方法特异性考察76-773.3结果与讨论77-943.3.1检测仪器的选择773.3.2采用适配体修饰的磁球检测HNE77-903.3.2.1酶催化反应条件的优化77-843.3.2.2HNE的检测84-863.3.2.3方法特异性考察86-883.3.2.4血清中HNE的检测88-903.3.3采用适配体修饰的微孔板检测HNE90-933.3.3.1HNE的检测90-923.3.3.2方法特异性考察92-933.3.4HNE检测方法的比较93-943.4结论94参考文献94-97第四章基于适配体捕获和荧光底物(AAPV)_2-R110)催化水解的弹性蛋白酶分析法97-1154.1引言974.2实验部分97-1004.2.1仪器和试剂97-984.2.2适配体修饰的磁球的制备984.2.3酶催化反应条件的优化98-994.2.4HNE的检测994.2.5方法特异性考察994.2.6血清中HNE的检测99-1004.3结果与讨论100-1134.3.1pH对荧光检测的影响1004.3.2酶催化反应条件的优化100-1054.3.2.1底物溶剂的影响100-1024.3.2.2pH的影响1024.3.2.3钙离子的影响102-1034.3.2.4钠离子的影响103-1044.3.2.5反应温度的影响1044.3.2.6底物浓度的影响104-1054.3.3HNE的检测105-1104.3.4方法特异性考察110-1124.3.5血清中HNE的检测112-1134.4结论113参考文献113-115第五章基于芘单体修饰的适配体荧光开关检测凝血酶115-1375.1引言115-1175.2实验部分117-1185.2.1仪器和试剂1175.2.2实验条件的优化117-1185.2.3凝血酶的检测1185.2.4特异性实验1185.2.5血清中凝血酶的检测1185.3结果与讨论118-1335.3.1探针的选择118-1205.3.2实验条件的优化120-1265.3.2.1温育时间的影响120-1215.3.2.2pH的影响121-1225.3.2.3钠离子的影响122-1235.3.2.4钙离子的影响1235.3.2.5镁离子的影响123-1245.3.2.6钾离子的影响124-1255.3.2.7探针量的影响1255.3.2.8温育温度的影响125-1265.3.3凝血酶的检测126-1295.3.3.1以Th-27-py为信号探针检测凝血酶126-1275