流式细胞术在肿瘤学中的应用ppt课件.ppt

流式细胞术在肿瘤学中的应用 1 什么是流式细胞仪 FlowCytometer FCM 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器 2 流式细胞术 流式细胞术是应用流式细胞仪对悬浮液中的细胞或细胞器进行快速测量和多参数检测的细胞分析技术 是上世纪70年代在单细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞理化特性 诸如大小 DNA RNA 蛋白质 抗原等进行快速测量并分类收集的高科技技术 它综合了激光技术 计算机技术 流体力学 细胞化学 单克隆抗体 荧光化学 分子生物学等各门学科 在对细胞群体的亚群进行定量分析时 具有其它手段无法比拟的优越性 3 流式细胞仪特点及检测标本 特异性强 灵敏度高 速度快 并能实现多参数分析 可检测的样本种类多样 1 外周血 骨髓 细针穿刺 洗脱液 实体组织 培养细胞 2 血清 血浆 培养上清 细胞裂解液 4 细胞周期及DNA倍体分析在临床肿瘤中应用免疫指标检测在临床肿瘤中应用监测癌基因与抗癌基因表达在肿瘤发生发展中的作用监测分析肿瘤多药耐药细胞凋亡 5 流式细胞周期与DNA倍体分析的基本原理 通过DNA检测进行细胞周期分析细胞周期 G0 G1 S G2 M细胞周期中DNA含量 G0 G1 2C 二倍体 S期 2C 4C G2 M 4C 四倍体 6 7 DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比 荧光强度与DNA所吸收荧光分子多少成正比 最常用的荧光染料 碘化丙啶 PI FCM分析细胞周期的基本方法 8 DNA含量的表示 细胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指数 DNAindex DI 表示相对含量 一个正常的二倍体细胞峰 其G0 G1期细胞DNA含量为2C DI值为1 0 DI 样本G0 G1期细胞峰平均荧光道数 正常二倍体标准细胞G0 G1期细胞峰平均荧光道数 9 DNA倍体的判定标准 二倍体的DI为1 0 四倍体的DI为2 0 变异系数 CV 标准细胞CV 3 新鲜组织标本 5 DNA倍体判定标准 DNA非整倍体具有2个分离的G0 G1峰 并根据DI值判断DNA倍体 10 对于一个正常人体的二倍体细胞群 G0 G1期占85 90 以上 S G2M细胞占10 15 以下 11 12 13 14 以二倍体参考细胞G0 G1期细胞DNA含量定为2C值DI 1 0 基于标准二倍体细胞的CV在5 以下 判定标准即 DNA二倍体 2C 2CV DNA异倍体不等于2C 2CV 1 DI 1 0 0 1 0 9 1 10 为二倍体 2 DI 1 0 0 15 0 85 1 15 为近二倍体 3 DI 2 0 0 1 1 90 2 10 为四倍体 4 DI 2 10为多倍体5 其余DI均为异倍体 15 16 17 18 19 20 流式细胞周期与DNA倍体的分析方法 一 单细胞悬液制备1 新鲜或冰冻实体组织 酶消化法 机械法 化学试剂处理法等 剪碎法 取新鲜或冰冻 浸泡于生理盐水中 实体组织0 5cm3 眼科手术剪剪碎 加入生理盐水 300目尼龙膜过滤 200g离心5min 生理盐水洗涤二次 21 半自动机械法单细胞制备系统 是目前较为理想的方法 简便 实用 单细胞获取率较高 特别适用于临床应用 22 由于各种实体组织成份 特性各不相同 对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法 才能使单细胞产量高 细胞损伤小 23 新鲜组织单细胞悬液制备注意事项 手术或活检的新鲜组织及时浸泡于生理盐水 立即送检 冷冻或冷藏 室温过高 放置时间过长而造成组织自溶发生 影响检测结果 24 25 26 27 28 29 30 2 石蜡包埋组织 扩大了FCM分析应用范围 并可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与利用 标体制备 二甲苯脱蜡法 组织清洁剂脱蜡法 甲酸双氧水处理法 注意事项 脱蜡完全 检验方法加入100 乙醇 如果无絮状物浮起 即可视为脱净 反之则没有脱净 掌握消化时间 避免细胞核消化掉 切片薄厚适宜 过薄碎片大多 过厚不宜脱蜡 31 32 33 34 35 3 骨髓 血液及体液 去除红细胞及浓缩有核细胞 骨髓及血液 淋巴细胞分离液 体液 一般需经300g离心5min PBS洗涤二次 如体液中红细胞太多 可用溶血素去除红细胞 注意事项 每次同时制备对照血液淋巴细胞标本 作为二倍体细胞外参标准 视标本中有核细胞浓度的高低进行调整 一般细胞浓度调至5 10 109 L 36 二 DNA染色及FCM分析 1 PI染色法应用BD公司CycleTESTIMKKit 1 单细胞悬液制备 2 加入A液250ul 放置10分钟 3 加入B液200ul 放置10分钟 4 加入冷C液200ul 避光放入2 8 C冰箱10分钟 置2 8 C冰箱避光保存 4h内FCM检测 37 5 流式细胞分析 流式细胞仪校准与设置 数据获取用Cellquest软件 SSC FSC FL2设置为线性放大 阈值设为FL2 收集图 FSC SSC和FL2W FL2A散点图 FL2 H或FL2 A荧光直方图数据分析 ModFit软件 38 流式细胞周期与DNA倍体分析在临床肿瘤学中应用 39 FCM分析在肿瘤早期诊断和监别诊断中的应用 DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志 有助于癌变的早期诊断 淋巴瘤在病理形态学还不能作出诊断前 FCM倍体分析可以提供准确的诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待 形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶变的可能 DI可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 40 FCM分析DNA含量和DNA倍体的预后意义 通常认为DNA含量高 非整倍体的肿瘤恶性程度高 预后差 二倍体或近二倍体肿瘤预后好 除DI及倍体外 反映肿瘤细胞增殖状态的S期细胞比例也被作为判断预后的指标 41 FCM分析在肿瘤脱落细胞学检查中的应用 FCM分析诊断肿瘤细胞的标准 1 发现DNA非整倍体细胞峰诊断为癌 2 如无明显的非整倍体细胞峰 但有一个突出的四倍体细胞峰和 15 的超