酵母菌分离筛选方法要点.doc

酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，圆形 椭圆 卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。1.培养基：1.1葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO42.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用）1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养用）（富集用）1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65水浴3-4小时，4-6层纱布过滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤，10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121 20min （分离保存用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） 1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）1.5 豆芽汁培养基： 黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121 20min PH自然 一般分离黄酒酵母 酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28 2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基 酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28 2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。3.筛选：分离：取集菌液适当稀释，吸取0.1-0.2ml梯度菌液（至少两个两个平衡），涂布于马铃薯-葡萄糖 麦芽汁或虎红培养基平板，也可采用混菌法或蘸取集菌菌液直接划线，（平放12h后倒置培养），25培养48h，低温酵母菌15 高温酵母菌 35 40 45，形成清晰菌落。在培养皿底划分小方格，待菌落生长良好后，用放大镜或低倍镜，观察每格内每个菌落编号并描述，颜色 表面 边缘 切面等，再制片在高倍镜下观察各菌株的个体形态，做好记录。选择不同菌落分别接于麦芽汁斜面，25培养48小时备用。纯化：培养基与分离培养基相同，否则，不同培养基菌落会改变形态，决不能认为菌落外观相同菌属于同一种。菌落外观相近的菌落，只能挑取一至数个菌落为代表进行纯化。常用方法为平板划线分离法：挑取单菌落于平板划线纯化菌株，25-28 2-3d，选择菌生长快 菌落大 典型继续纯化，每个分离物至少经两次划线，结合镜检保持菌株的纯度，对于保存菌株也应定期检查纯度。纯化的菌株转接于麦芽汁斜面25-28 2d 待鉴定或用灭菌液体石蜡封面于4冰箱保存。筛选：性能测定：根据不同需要，选择不同性能测定方法。产气性能比较：采用杜氏管发酵法，将斜面菌种两环接种于麦芽汁或豆芽汁液体培养基中（可以分两次加培养基），28振荡培养48h，产气时间和产气量。产酒精能力测定：采用蒸馏法测酒精含量。产香能力测定：通过嗅觉鉴定。 附：不同酵母菌的形态特征：酿酒酵母：在麦芽汁琼脂培养基上，菌落与细菌相似，比细菌大而厚，不透明，表面光滑，湿润粘稠，乳白色，形成假菌丝。单细胞，形状有圆形 椭圆形等，大小不一。在麦芽汁中，沉淀表面形成环状膜。不能利用硝酸盐。产朊假丝酵母：在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，平滑，有光泽或无光泽，边缘整齐呈菌丝状。细胞呈圆形 椭圆形和圆柱形等。能利用硝酸盐为氮源。实例1：大曲中酵母菌的分离及鉴定 1.富集培养：取5g样品，在试管中加入10ml麦芽汁培养基，同时加入一滴乳酸摇匀，25-2824h，后取1ml菌液转入另10ml麦芽汁培养基试管中培养25-28 24h，稍长(过长则霉菌长出)。培养液变浊产膜或沉淀。观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。要求：较高的糖50g/l， 抑菌剂 孟加拉红0.03 g/L（许多细菌 放线菌和快速生长的霉菌），PH 4.5。或用乳酸（5ml）-马铃薯（200g）-葡萄糖（20g）培养基富集。2.酵母菌分离：平板划线 涂布或混菌均可。取集菌菌液，梯度稀释，取 10-5 10-6 10-7,0.1ml菌液涂布虎红培养基上，25-28 48h（若不纯可挑取单菌落连续多次划线）。3.酵母菌选择：对典型单菌落，经美兰染色，制片镜检，进行描述性记录，然后选择不同菌落转接于麦芽汁斜面，25-28 48h备用。4.酵母菌纯化：挑取10-7 培养基不同的单菌落，在PDA培养基接种25-28 2-3d后，取形态不同的单菌落传接二次，观察菌落形态确定为单菌落后，分别接种于PDA培养基和MA培养基中，25-28 3d，根据在不同培养基中菌落形态进行初步分类。将所得菌株于斜面培养保存在4冰箱中。实例2：高温堆积糟醅中酵母菌的选育1.集菌：同上 45 2-3d，依此法转接2-3次，再行分离。2.分离：梯度菌液分别涂布于麦芽汁 麸皮汁 豆芽汁平板于45 2-3d，将平皿上生长的菌落划线纯化，菌株移入斜面，备用。3.有效菌株的确认：分离的数十株酵母经镜检有酵母属的各种酵母，假丝酵母，红酵母，白地霉等。用高粱粉糖化液，饴糖稀释液，麸皮等进行发酵，测定次生代谢产物，依次判出Y1 Y2 Y3 Y4等与酱香酒产量质量有关。4.菌种的分类鉴定：4.1形态特征：（麦芽汁琼脂）编号 形态特征Y1 菌落由白色到奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。边缘呈波纹，凸起，色黄，中心凹，奶油色，室温放一月后，培养物由奶油色变浅褐色。细胞呈圆 卵圆 椭圆，大小不等。单个，成双，偶尔成短链，多边芽殖。 （意大利酵母） Y2菌落呈浅奶油色，菌落平滑或部分有皱纹，无光泽，边缘呈黄色，大波纹状。细胞圆形卵形 椭圆形，大小不等，多边芽殖。 (地生酵母)Y3 28 3d后，细胞圆形 椭圆形，单个或成双，两端芽殖，培养物奶油状，奶油色到浅褐色，平滑，稍平坦，光亮，边缘偶尔波纹，无真菌丝。 （酿酒酵母）Y4 菌落白色至奶油色，无光泽，软而平滑或部分有皱纹。培养时间偏长菌落渐硬，并呈菌丝状，不易挑起。在麦芽汁平皿上，菌落白色，凸起，有皱纹，边缘波纹状。细胞较小，卵圆 椭圆形，有大量真菌丝。 （间型假丝酵母）4.2生理生化特征4.2.1发酵糖类： 酵母菌发酵液成分分析 Y1 Y2 Y3 Y4 香 气 稍酱香，酯香 稍酱香，酯香 酯香 醇甜香酒精（%） 3.9 3.9 4.3 5.1代谢产物 乙 丙 丁 乳 异戊酸 同Y1 除硫甲基丙醇 乙 丙 丁 乳酸 乙醛 乙酯 乳酯 丙醇 其他成分均有 乙醛丙醇异丁醇 异丁醇 异戊醇 戊醇 异戊醇 硫甲基丙醇 各种酵母发酵糖类结果 Y1 Y2 Y3 Y4 葡萄糖 + + + +D-半乳糖 + - + -麦芽糖 + - + +蔗糖 + - + +乳糖 - - - +棉子糖 - - + +蜜二糖 纤维二糖海藻糖松三糖菊糖可溶性淀粉-甲基-葡萄糖苷 同化碳源葡萄糖 + + + +D-半乳糖 + - + -麦芽糖 + - + +蔗糖 + - + +乳糖 + - - +棉子