DNA印迹原理.doc

DNA印迹原理：用合适的限制性内切酶消化DNA，电泳分离DNA片段，利用毛细作用，使液体经过凝胶，使DNA片段由液流携带而从凝胶转移并结合在固体支持物表面（NCM），然后进行杂交。作用：检测待定基因的大小、拷贝数、变异等。步骤：DNA的抽提、质量检测；限制性内切酶操作；DNA的琼脂糖凝胶电泳分离、0.4NNaOH变性；转膜（毛细管渗吸或电转移）；80处理或紫外线照射将DNA固定在膜上；探针制备、检测等。应用/意义：特定基因定性定量检测；基因突变分析；酶切图谱分析；基因重排和丢失检测。Northernblotting步骤：RNA(mRNA)提取，限制性内切酶消化，变性凝胶电泳分离RNA片段，转膜，预杂交，杂交，放射自显影。应用：RNA的定性定量研究，mRNA表达高低，癌基因、抑癌基因活化。补充：southwesternblotting：该方法结合了westernblot和Southernblot两种试验方法而发展起来的检测与特意DNA序列相结合的DNA结合蛋白的方法。基本原理：细胞核蛋白提取物经过SDS-PAGE后，转移至NCM上，然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。Immunochemistry：基本原理：应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞或组织中多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。PCR基本工作原理？反应三步骤？应用？在医学上具体应用？成败的关键因素？PCR聚合酶链反应：又叫无细胞分子克隆、体外基因扩增技术。利用人工合成的一对引物，在被扩增DNA模板链的两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间的聚合反应。PCR基本原理：是以体外酶促反应的方式，模拟天然的DNA复制过程。以待扩增DNA片段为模版，根据其5-3端的核苷酸顺序，设计一对与之互补的寡核苷酸为引物，模版DNA高温变性解链，低温退火，引物与摸板DNA单链的互补顺序结合，中温条件下，通过TaqDNA聚合酶作用，以四种dNTP为原料，单链DNA模版逐步延伸，合成新的DNA互补链。这样的三步反应为一个周期，每一周期产物又可作为新模板进行新的合成反应。n次循环后，拷贝数增加2n倍。一般经过2530个循环，拷贝数可扩增上百万倍。经过电泳、染色，可直接观察待测基因存在与否，不需要与基因探针分子杂交。常见几种PCR：逆转录PCR（RT-PCR）；巢式PCR；RACE；反向PCR；定量PCR-realtimePCR；半定量PCR。PCR的基本反应步骤：高温变性、低温退火、中温延伸。高温变性：将双链DNA加热（95）使之变性，DNA双链变成单链；低温退火/复性：降低温度至3756（Tm-5）使引物与模板DNA单链结合；中温延伸：将温度升至72，TaqDNA聚合酶以dNTP为底物，催化合成一条与模板互补的新链（在引物3端进行延伸），使原模板DNA的一条链变成两条链。PCR应用：扩增基因，cDNA文库及筛选，直接测序，染色体特异区带片段克隆，检测突变，简并引物扩增未知序列，标记探针。医学上具体应用：病原体的检测，遗传病基因诊断，肿瘤相关基因诊断，组织配型，法医、亲子鉴定。成败的关键因素：实时PCR/荧光定量PCR？原理？优点？与普通PCR的不同及优势？RealtimePCR/实时PCR/荧光定量PCR：是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对位未知的模板进行定量分析的方法。原理：1、在Taqman寡核苷酸探针的5端标记一个报告荧光染料，3端标记一个猝灭染料。当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料发射的荧光信号被猝灭染料吸收不发光。2、PCR产物扩增时，Taq酶遇到了结合在模板上的Taqman寡核苷酸探针，其5-3外切酶活性将探针酶切降解，荧光报告染料与猝灭染料分离，荧光共振能量转移不再发生，报告荧光发射的荧光强度与被切掉的探针成正比。实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，由此可以计算PCR产物的含量。3、如果用相同模板量的不同样本进行TaqmanPCR扩增时，相同时间分析荧光强度可以发现产物含量的差异，这实际上是基因模板含量不同所致，由此可以推测基因拷贝数的变化情况。优点：准确定量结果；特异性更高；闭管操作防止污染；全自动化反应、数据收集和分析；无需凝胶电泳；高通量；阳性内参照防止假阴性结果。基因治疗的主要策略？步骤？基因治疗：是指从DNA水平所采取的一切治疗措施和新技术。例如向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷；或采用特定方式关闭、抑制异常表达的基因从而达到治疗的目的。途径：生殖细胞基因治疗（存在伦理学障碍，不考虑人类）；体细胞基因治疗（主要是转基因治疗）。主要策略：1、基因标记：解决：外源基因能否安全转移到患者体内；从患者体内取出的细胞能否检测到转移基因的存在。2、基因置换/矫正：将特定目的基因导入特定细胞，通过定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列。3、基因添加：导入外源基因，使靶细胞表达其本身不表达的基因。4、基因干预：是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。基因干预的主要方法：反义RNA；RNAi；核酶裂解特异的靶mRNA；三链DNA。基因治疗的步骤：克隆治疗基因；选择合适靶细胞；通过载体将治疗基因导入靶细胞；目的基因在受体细胞内的有效表达。癌基因？抑癌基因？激活机制？癌基因与肿瘤发生的关系？癌基因：细胞基因组中具有能使正常细胞发生恶性转化的基因，称为癌基因。癌基因是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性，在癌基因异常表达时，其产物可使细胞无限分裂。抑癌基因/抗癌基因/肿瘤易感基因/隐性癌基因：是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。在正常细胞的增殖调控信号中，原癌基因起正调控作用，抑癌基因起负调控作用，抑制细胞增殖，促进细胞成熟，朝向终末分化和凋亡，维持基因稳定。原癌基因激活机制：1.原癌基因点突变：原癌基因的表达产物多有促进细胞增殖的功能，当点突变发生后：该蛋白质的活性可大大增强，对细胞增殖的刺激作用也增强；该蛋白质的稳定性可能增加，导致其在胞内浓度增加，对增殖刺激的时间和强度也随之增加；可能会引起RNA的错误剪接而改变蛋白质的结构与功能。2.原癌基因获得启动子与增强子；3.原癌基因扩增：原癌基因通过某些机制在原染色体上复制出多个拷贝表达产物异常增多加速细胞增殖。4.原癌基因移位或重排：癌基因从所在染色体的正常位置易位到另一染色体的某一位置上，使其调控环境发生改变，从相对静止状态转为激活状态。基因工程的操作过程？/重组DNA技术的基本步骤？意义？分切-接转筛。1、目的基因和载体的分离纯化：目的基因的获取：化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCR。载体：质粒、噬菌体、病毒三大类载体均经人工构建，除去致病基因，有筛选标志、单一限制酶切点.2、目的基因和载体的切断：通常用限制性核酸内切酶分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组.3、重组DNA连接：目的基因与载体连接，构建重组DNA分子：粘性末端连接：同一种限制酶酶切目的基因和载体，产生相同粘性末端，DNA连接酶将两者连接。平头末端连接：T4DNA连接酶。两个具有平头末端的双链DNA分子链接。问题：低效率、串珠现象。若要提高平末端DNA分子连接的效率：加入大分子凝聚剂、加大连接酶的量；同聚物加尾法：末端转移酶TTE。在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组DNA分子；人工接头连接法：合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切割，产生粘性末端连接。4、重组DNA导入宿主细胞进行增殖和表达/重组DNA的转化和扩增。受体为细菌时-电击法、热击法（氯化钙）；受体为真核生物时-电击法、基因枪、显微注射法。导入的类型：转化transformation：以质粒作载体的重组体导入受体细胞的过程。转染transfectim：以病毒作载体。转导conduction：以噬菌体作载体5、重组DNA的筛选与鉴定：筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法：平板筛选：插入失活筛选、蓝白斑筛选；限制酶切图谱筛选；PCR筛选；原位杂交技术。6、受体细胞中目的基因的功能表达，表达产物的检测和分离纯化。意义：填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；缩短了生物进化的时间；使人们能够对生物进行定向改造。举例说明两种重组DNA转化的方法？1、基因枪转化/微粒轰击法：外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。将载有外源基因的m或亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。2、电击法/电穿孔转化：利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。3、显微注射法：在显微镜下将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适用于各种培养生长的细胞，但需要一定设备和操作技巧。补充：常用工具酶：限制性内切酶II型：仅需要Mg2+作为催化反应的辅助因子（I,III型需要Mg2+，ATP，SAM）。能识别由46个核苷酸组成的特定核苷酸序列（即限制性内切酶的识别序列/位点），并在识别序列切割DNA分子。这些识别序列的共同特点是具有双螺旋对称结构。II型限制性内切酶不具有甲基化修饰活性（这一功能由相应的修饰酶承担）（I,III型有甲基化酶活性，兼具修饰、切割功能）。有一些来源不同的限制性内切酶能识别同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶。产生同样的切割，形成同样的末端。有一些酶虽然来源各异，识别的核苷酸序列也不相同，但能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。由同尾酶切割产生的DNA片段，是可以通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的-在基因工程操作中有重要价值。DNA聚合酶：能将脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合。DNApolI：5-3聚合活性、5-3外切活性（被前者抑制）、3-5外切活性。用途：探针标记；补平3末端。Klenow大片段酶：DNA聚合酶I的水解产物之一，保留了5-3聚合活性、3-5外切活性。T7DNA聚合酶：有很强的聚合能力，聚合长度比其他聚合酶大得多。DNA连接酶：将来源不同的DNA片段连接并封闭起来组成新的重组DNA分子。催化连接反应时，需要一条DNA链3末端有一游离羟基（-OH），另一条DNA链5末端有一个磷酸基团（-P），这样相邻的3-OH与5-P之间可形成3-5磷酸二酯键。吸能反应，需要NAD或ATP提供能量。只能封闭缺口（nick，失去磷酸二酯键），不能封闭缺口（gap，失去一个或数个核苷酸而形成的单链断裂）。T4DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更常用，即可催化粘性末端连接，又可催化平头末端连接。逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶；RNA指导的DNA聚合酶。使用最为普遍的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV的逆转录酶。主要用途：cDNA合成；制备杂交探针。T4多核苷酸激酶：催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端。可用于探针标记DNA的5末端，还可用于使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。TTE末端转移酶：5-3聚合活性，当反应体系仅有一种dNTP时，可形成3末端同聚物尾巴。APE碱性磷酸酶：切除末端磷酸基团。使5-P5-OH。标记探针：5-P通过APE变成5-OH，再通过T4多核苷酸激酶，变为5-P（标记）。分析一个基因的功能，你认为可以从那几方面着手？采用哪些方法？象。若要提高平末端DNA分子连接的效率：加入大分子凝聚剂、加大连接酶的量；同聚物加尾法：末端转移酶TTE。在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，然后在DNA连接酶作用下连接成为重组DNA分子；人工接头连接法：合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切割，产生粘性末端连接。4、重组DNA导入宿主细胞进行增殖和表达/重组DNA的转化和扩增。受体为细菌时-电击法、热击法（氯化钙）；受体为真核生物时-电击法、基因枪、显微注射法。导入的类型：转化transformation：以质粒作载体的重组体导入受体细胞的过程。转染transfectim：以病毒作载体。转导conduction：以噬菌体作载体5、重组DNA的筛选与鉴定：筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法：平板筛选：插入失活筛选、蓝白斑筛选；限制酶切图谱筛选；PCR筛选；原位杂交技术。6、受体细胞中目的基因的功能表达，表达产物的检测和分离纯化。意义：填平了生物种属间不可逾越的鸿沟；缩短了生物进化的时间；使人们能够对生物进行定向改造。举例说明两种重组DNA转化的方法？1、基因枪转化/微粒轰击法：外源基因导入组织或细胞的一种物理学转化方法。将载有外源基因的m或亚微米级的金属微粒（钨或金粉）加速，高速轰击并射入受体靶细胞的方法。2、电击法/电穿孔转化：利用高压电脉冲的电激作用将外源基因导入细胞的转化方法。3、显微注射法：在显微镜下将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适用于各种培养生长的细胞，但需要一定设备和操作技巧。补充：常用工具酶：限制性内切酶II型：仅需要Mg2+作为催化反应的辅助因子（I,III型需要Mg2+，ATP，SAM）。能识别由46个核苷酸组成的特定核苷酸序列（即限制性内切酶的识别序列/位点），并在识别序列切割DNA分子。这些识别序列的共同特点是具有双螺旋对称结构。II型限制性内切酶不具有甲基化修饰活性（这一功能由相应的修饰酶承担）（I,III型有甲基化酶活性，兼具修饰、切割功能）。有一些来源不同的限制性内切酶能识别同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶。产生同样的切割，形成同样的末端。有一些酶虽然来源各异，识别的核苷酸序列也不相同，但能产生相同的粘性末端，称为同尾酶。由同尾酶切割产生的DNA片段，是可以通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的-在基因工程操作中有重要价值。DNA聚合酶：能将脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合。DNApolI：5-3聚合活性、5-3外切活性（被前者抑制）、3-5外切活性。用途：探针标记；补平3末端。Klenow大片段酶：DNA聚合酶I的水解产物之一，保留了5-3聚合活性、3-5外切活性。T7DNA聚合酶：有很强的聚合能力，聚合长度比其他聚合酶大得多。DNA连接酶：将来源不同的DNA片段连接并封闭起来组成新的重组DNA分子。催化连接反应时，需要一条DNA链3末端有一游离羟基（-OH），另一条DNA链5末端有一个磷酸基团（-P），这样相邻的3-OH与5-P之间可形成3-5磷酸二酯键。吸能反应，需要NAD或ATP提供能量。只能封闭缺口（nick，失去磷酸二酯键），不能封闭缺口（gap，失去一个或数个核苷酸而形成的单链断裂）。T4DNA连接酶较大肠杆菌DNA连接酶更常用，即可催化粘性末端连接，又可催化平头末端连接。逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶；RNA指导的DNA聚合酶。使用最为普遍的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒AMV的逆转录酶。主要用途：cDNA合成；制备杂交探针。T4多核苷酸激酶：催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端。可用于探针标记DNA的5末端，还可用于使缺失5-P末端的DNA发生磷酸化作用。TTE末端转移酶：5-3聚合活性，当反应体系仅有一种dNTP时，可形成3末端同聚物尾巴。APE碱性磷酸酶：切除末端磷酸基团。使5-P5-OH。标记探针：5-P通过APE变成5-OH，再通过T4多核苷酸激酶，变为5-P（标记）。分析一个基因的功能，你认为可以从那几方面着手？采用哪些方法？如欲在转录水平检测某种基因的表达，应该用哪些方法？举例说明其原理。选择个别基因在何种特定的组织或细胞、特定的体内外条件或发育阶段进行表达。主要涉及3种因素的相互作用：RNA聚合酶；顺式调控元件；反式作用因子顺式调控元件的研究方法：1、报告基因(reportergene)：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。2、转染（transfection）：通过生物学、物理学、化学等方法使外源DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转染。3、5缺失突变实验：鉴定真核基因DNA上游转录调控序列的调控元件：1个位于2与3之间；另一个位于4与5之间。反式作用因子的研究方法：转录因子活性谱芯片生物样品(组织或细胞)；抽提核蛋白，蛋白浓度测定；核蛋白与转录因子结合序列的混合物共同孵育分离回收与核蛋白中转录因子发生结合的探针；扩增并荧光标记；芯片杂交和扫描；数据分析生物信息学方法：TRANSFAC数据库，这个数据库从发表的文献中收集了转录因子、转录因子结合部位及结合部位序列信息。HorsmanS等设计出一个BLAST搜索工具，称之为TFtargetmapper。此软件能够快速提取靶点附近基因的注解信息，有助于全面分析调控信息，并有利于弄清楚特异转录因子的作用机制，最终了解这些转录因子在生物体的哪些途径中发挥作用。DNA损伤修复的机制？（一）直接修复：修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除DNA或切除碱基。1.光修复-针对嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有。过程：UV照射下，形成嘧啶二聚体；光复活酶与T=T结合形成复合物；酶被可见光所激活（最佳波长400mm），切断T=T之间的共价键，二聚体变为单体；修复后释放酶。2.链断裂的重接-针对DNA单链断裂。DNA连接酶。普遍存在，容易进行。双链断裂几乎不能修复。3.碱基的直接插入-针对AP位点。DNA嘌呤插入酶。（二）切除修复s最普遍的修复形式，针对多种DNA损伤：AP位点、嘧啶二聚体、链断裂、碱基烷基化等。s多步骤多酶参与的过程：DNA内切酶、外切酶、连接酶、聚合酶等共同作用下，将受损部位切除，并以另一条链为模板合成修复。s特点：暗修复；复制前修复；修复对象为亲代DNA。s过程：内切酶识别损伤位点，并在其两侧切开；外切酶除去两个切口之间的核苷酸；聚合酶催化DNA合成；连接酶连接。（三）重组修复s当DNA损伤较大，无法及时修复or缺乏切除修复酶系，可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后在重组基因rec编码的酶（rec蛋白）、DNA聚合酶、DNA连接酶作用下，进行重组修复。s特点：复制后修复。模版上伤疤始终留着，只是随重组修复次数逐步稀释。修复对象为子代DNA。s过程：复制：损伤母链复制时，跳过损伤部位，子链对应位点留下缺口，无损母链复制成完整双链。重组：有缺子链与无损母链发生重组，缺口转移至无损母链，使损伤母链的互补链完整，损伤母链依然保留。再合成：转移后的母链缺口以新的互补链为模板聚合补齐。（四）SOS修复sDNA受到严重损伤难以继续复制，或DNA复制系统受抑制的紧急情况下，为了保证DNA链的完整性，应急产生校对功能较低的修复酶，采用填补任意碱基的方式修复。这是具有差错的修复，是对极为不利的外界环境的应急反应，故称为SOS修复，也称差错倾向修复。广泛存在于原核生物与真核生物。细胞能存活，但变异率高，DNA保留错误较多，会引起广泛、长期的突变，自然界也因此而变的物种繁多。基因突变？其后果（意义）？基因突变（genemutation）：由于DNA分子中发生碱基对的替换、插入、缺失等,从而引起基因结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的时间：DNA复制时期，即细胞分裂间期（有丝分裂和减数分裂）基因突变若发生在体细胞，则影响其功能和生存。可导致疾病甚至癌变或死亡-不遗传；若发生在生殖细胞，则可能影响后代-可遗传。基因突变的特性：普遍性、随机性、低频性、可逆性、多害少利性。基因突变的形式：替换、缺失、插入、重排。(一)点突变/替换：指DNA分子上一个碱基对的变异：1.转换(transition)：同型碱基间的置换:嘌呤代替另一嘌呤，嘧啶代替另一嘧啶。2.颠换(transversion)：异型碱基间的置换：嘌呤变嘧啶，嘧啶变嘌呤。(二)插入(insertion)；缺失(deletion)：引起三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变-框移突变。正常5GCAGUACAUGUC缺失C5GAGUACAUGUC丙缬组缬谷酪蛋丝(三)重排(rearrangement)/重组：指DNA分子内发生较大片段的交换，也称为重组。移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。突变的意义：1、突变是进化、分化的分子基础：产生新基因的途径；生物变异根本来源；为生物进化提供原始材料。2、突变导致基因型改变：仅改变基因型而无可察觉的表型改变；本质上来讲，多态性的产生在于基因突变，一般发生在基因序列中非编码区。对个体而言，基因多态性碱基序列终生不变，并世代相传。3、突变导致死亡：突变若发生在对生命至关重要的基因上，可导致个体或细胞的死亡。4、突变是某些疾病的发病基础：包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的疾病。点突变：镰刀型红细胞贫血。血红蛋白HB基因发生碱基对置换红细胞形状改变。衰老细胞的生物学和形态学特征？生物学特征：1、细胞阻滞于G1期，无法进入S期；2、不可逆丧失对有丝分裂原的反应能力；3、调控细胞生长的关键基因的表达发生变化，正向转录因子抑制，负向转录因子过量表达；4、细胞功能“脱分化”；5、发生凋亡的能力下降。形态学特征：1、细胞核增大，核内出现包含物，核膜内陷，染色质凝聚；2、细胞质内色素积累，脂褐质积累，影响细胞正常功能，细胞工作效率降低，出现衰老。3、细胞膜流动性降低，干扰了膜蛋白的正常结构与功能。4、线粒体数目减少，体积增大；5、高尔基体囊泡肿胀，出现扁平囊泡断裂崩解，分泌及运输功能衰退。6、内质网排列无序，膜腔扩大甚至崩解，膜上核糖体数目减少.建立转基因动物模型的基本原理和应用？凋亡凋亡：多细胞生物为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动的的有序性的自我消亡，又称细胞程序性死亡PCD。从严格意义上来说，凋亡与PCD有很大区别。PCD：多细胞生物个体发育过程中，预定的并受到严格程序控制的细胞死亡。是一个功能性概念、发育学概念。仅存在于发育细胞。而凋亡是形态学概念，可存在于发育细胞及成体细胞。大部分凋亡是PCD，但某些凋亡明显是非程序性，如细胞毒物诱导的凋亡。凋亡的形态学特征：早期：胞浆脱水浓缩，胞膜空泡化，染色质固缩成新月形，边集于核膜下。晚期：凋亡小体形成（内含有结构完整的细胞器）；最后：凋亡小体被邻近细胞或吞噬细胞所吞噬清除。凋亡的生化特征：染色质DNA片段化：内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接DNA降解，形成长度为180200bp整倍数的寡聚核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈现特征性的梯状条带ladder；内源性核酸内切酶激活，凋亡中执行DNA切割，作用位点在核酸内部磷酸二酯键；凋亡蛋白酶caspase激活：caspase是一类促凋亡的蛋白水解酶，活性中心富含半胱氨酸Cys，对底物的天冬氨酸部位Asp有特异性水解作用。Caspase蛋白酶的级联反应是导致凋亡结构改变的主要环节。钙离子浓度上升：外钙流入，内钙释放，启动凋亡。线粒体改变：膜通透性上升，释放Cyto-C启动凋亡。（Cyt-C，AIF均为线粒体释放的促凋亡蛋白）细胞凋亡的4阶段：凋亡信号转导（凋亡诱导因素+受体+cAMP,Ca2+，神经酰胺）；凋亡相关基因激活；细胞凋亡的执行（caspase激活，DNase激活）；凋亡细胞的清除（巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞）细胞凋亡的信号转导：多样性、偶联性、同一性、多途性。死亡受体通路：死亡配体（细胞外）死亡受体（细胞膜）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）激活caspase8激活caspase3细胞凋亡。死亡受体：膜蛋白，如TNFR、Fas、DR3、DR4、DR5等。线粒体通路：凋亡复合体形成，激活caspase9；凋亡诱导因子AIF释放，激活DN