现代生物技术在天然药物中的应用.doc

现代生物技术在天然药物中的应用摘要：天然药物是指动物、植物、和矿物等自然界中存在的有药理活性的天然产物。以生物技术为核心的现代高技术在天然药物资源的研究开发领域内发挥着越来越重要的作用。本文综述了近年来生物技术在动物药研究中的应用；在植物药方面的应用及在海洋药用生物资源开发以及海洋天然活性产物研究中的应用。并就其研究前景进行讨论和展望。关键词： 生物技术 天然药物 应用现代生物技术是在分子生物学基础上建立的创建新的生物类型或新生物机能的实用技术，是现代生物科学和工程技术相结合的产物。包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程。天然药物是指动物、植物、和矿物等自然界中存在的有药理活性的天然产物。天然药物不等同于中药或中草药。随着社会的发展，人们越来越关注化学药品给人类自身健康及生活环境带来的负面影响；回归自然、保护环境已成为一种处理人类和环境关系的潮流思想。包括植物药、动物药和海洋药物的天然药物的研究和开发顺势大力发展，对天然药物的各种人为禁制也趋于宽松。也启迪人们在天然药物研究、开发、生产中迸发全新的思路。1、 现代生物技术在动物药研究中的应用动物药是我国医药宝库的重要组成部分，是中药三大来源之一，其传统研究思路以中医理论为指导，重点研究临床应用等相关方面，主要包括：本草考证、资源调查、基源鉴定、动物药化学、加工炮制、药效研究、品质评价等1。动物药研究起步较晚，动物药的系统研究整理工作始于20世纪60年代，基础薄弱，存在较多空白，加之传统动物药研究理论不完善，符合动物药研究特色的方法学尚未建立，如何合理有效的借鉴现代技术手段也不明确。2 随着生物领域技术的发展，现代生物技术已逐渐广泛应用于动物药研究领域，并取得了可喜进展。11 生化分离技术1.1.1 色谱分离技术 色谱分离技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、亲和色谱等。对于生物大分子的分离，只使用单一的色谱方法很难将待分离物质完全分离，通常将几种原理不同的色谱技术组合起来以获得理想的纯化效果。魏金荣等3采用一步亲和色谱法分离纯化了白眉蝮蛇蛇毒中的降纤酶，得到的降纤酶纯度高达99以上。1.1.2 电泳技术的应用电泳技术是一种广泛使用的蛋白质和核酸分离分析技术。通过电泳可以准确简便的比较大量样品，并获得蛋白质图谱。将两种基于不同分离原理的电泳方法进行组合能够大大提高分离效果，如双向电泳。目前电泳技术已经广泛应用于动物药的鉴定研究。利用动物药药材中的不同组分具有不同的电荷特性，在同一电场下泳动距离存在差异而实现鉴定。史克莉等4利用SDS-PAGE技术对3种蜂王浆、牛血清蛋白、金钱白花蛇、乌梢蛇、鹿蹄筋、炮制前后的蝎子进行了鉴别分析。古今等5应用高效毛细管电泳技术鉴别了冬虫夏草及其伪品，方法简便、快速、准确，可作为冬虫夏草及其伪品的有效鉴别方法。1.1.3 其他分离技术沉淀分离、膜分离、离心分离、泡沫分离等技术作为常用生化分离制备手段的必要补充在动物药研究中的应用同样重要。1.2 蛋白质组学技术的应用1.2.1 蛋白质样品制备技术动物药药材涉及物种面宽，入药部位种类繁多，对于不同药材蛋白质样品制备应选择与药材特点相适应的方法手段，如水蛭、蜈蚣等药材的提取条件相对较缓和，而对于质地坚硬的水牛角、珍珠等药材的提取条件应该适当剧烈些。较为温和的裂解细胞的方法有渗透溶解、反复冻融裂解、表面活性剂裂解、酶溶法等。为了防止提取过程中蛋白质降解或被氧化，可以选择性的加入蛋白酶抑制剂或抗氧化剂，同时还要注意操作过程中应当尽量低温进行，防止蛋白质变性。较为剧烈的提取方法有超声波处理法、压力杯法、机械研磨法、机械匀浆法等。而药典记载多数动物药的常用提取方法为水煎煮，虽然在如此剧烈的条件下蛋白质已经变性或降解，但是得到的提取液仍具有活性，说明动物药中变性蛋白或多肽可能具有生物活性。1.2.2 蛋白质的鉴定 动物药药材来源广泛，资源丰富，药用动物物种从单细胞动物到哺乳动物跨度大，种类繁多，而即使是同一物种，也因其所处发育阶段、生理条件、栖息环境等不同，使得动物药药材中的蛋白质组成不尽相同，各有特点. 因此，针对动物药的研究急需合理可靠的方法体系对其进行综合评价。黄春洪等6利用双向电泳和二维色谱有效分析了尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质组和生物活性。蛋白组学技术在研究蛋白质、多肽等复杂体系方面有其独到之处，必将会给动物药的研究带来良好的应用前景2、 现代生物技术在植物药中的应用由于人类对自然界的持续性破坏，野生药材资源日益减少。传统栽作中存在着有效成分含量不稳定；农药、重金属含量超标；栽培品系的品质日渐退化以及产量远远不及工业化大生产的要求等一系列问题，严重阻碍了中药的现代化进程。引进生物技术，可以对中药材品质进行多方面的改进。2.1 转基因技术 近年来，基因工程技术应用为培育新品种提供了强有力的手段。1991年Broglie等首次报道转菜豆几丁质酶基因的烟草可抗真菌病7。如果转基因技术能够将转基因表达稳定地传递给后代，那么就可从后代中筛选出纯合抗病、高产、优质的个体，培育成为优良品系。利用转基因技术可根据预定的目标进行目的基因的转移，以改进植物的遗传特性，但在药用植物方面的研究仍未见报道。2.2 试管苗快速繁殖技术试管苗快速繁殖技术即利用植物培养技术将植物的分生组织进行离体培养，建立无性系并诱导分化为完整植株。目前运用较多的技术有利用发根农杆菌感染植物组织形成毛状根及利用根瘤农杆菌感染植物组织形成畸形芽以获取再生植株。现已有数十味中药材如石斛、芦荟8等经离体培养分化成植株，这对于珍稀药材的保存和繁殖具有重要意义。23 次生代谢产物的生产植物细胞培养技术现已发展成为一门较为完善的实验科学，然而为了使植物细胞能工业化生产次生代谢产物国内外学者提出许多途径提高代谢产物的含量，简化提取过程，其中包括二步培养技术、两相培养技术、冠瘿培养技术、毛状根培养技术、反义技术等。3、 现代生物技术在海洋药物研究中的应用20世纪60年代初日本学者对河豚毒素的研究是人类对海洋天然活性成分研究的开端，从70年代开始，在国际上兴起了海洋天然产物研究的高潮，经30余年的发展，以海洋天然活性产物为研究内容已成为目前天然产物化学中的一个重要分支9。到目前为止，各国研究人员已从不到1%的海洋生物种群中发现各种具有生物活性的天然产物1000余种，它们广泛分布于海洋微生物（包括生活在海洋中的细菌、真菌和放线菌）、海洋植物（包括各种海藻等）以及海洋动物中，这些天然活性成分主要包括抗生素类、大环内酯类、萜类、生物碱类、多糖类、多肽和蛋白质以及聚醚类等10，它们在抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗心血管疾病以及抗衰老等领域具有广阔的应用前景，其中有一些活性成分，如：Ara-A、Didemnin 等，已被开发成新药或进入临床研究阶段11，这些工作吸引了众多科研人员和医药界有关人士的关注。自80年代以来，现代生物技术已广泛应用于生物医学研究的各个领域，在海洋生物资源研究与开发中的应用已发展成为一个新兴的研究领域海洋生物技术，即“利用海洋生物或其组成部分生产有用的生物产品以及定向改良海洋生物遗传特性”的一门综合性科学技术123.1 海洋生物的培养 海洋是一个特殊的生态环境，从某种角度来看：海洋自身就是一个复杂的培养体系，在其特有的压力、温度以及盐份环境下，海洋生物体内产生了一些不同于陆生生物体内的高生物活性物质。因此，如何保持采集到的海洋生物生活在一个类似海洋环境的实验室中，在某种程度上是能否获得高生物活性物质的前提。3.1.1 海洋微生物及海洋微藻的纯化和培养采集自海洋的目标微生物和微藻中常混杂有大量的其他微生物，一般可通过平板划线、涂布平板以及混合平板等方法对菌种加以纯化。现已发展了多种海洋微生物或海洋微藻的培养方法，但尚未找到一种通用的适合各种海洋微生物或海洋微藻培养的方法。在微生物及海藻的培养过程中，除必须加入必要的营养成分外，还需要考虑到这些微生物或微藻的生态环境，如温度、光照、压力、通氧状况以及盐分等13，这需要对采样点的环境加以充分的研究，解决温度、压力以及通氧情况需要特殊的培养设备，盐分则可通过在培养基中加入无菌海水或人造海水的方法加以解决，接近于自然生活环境的培养基成分及相似的培养条件是培养获得成功的关键。目前，康瑞娟等14利用一种气升式光生物反应器在海藻的高密度培养中获得了成功。3.1.2 大型海藻的培养大型海藻除具有较高的经济价值外，还可以作为基因工程药物的表达体系15，属新一代的“生物反应器”。其组织培养工作开始于20世纪50年代，然而，由于大型海藻富含粘液（主要成分是多糖类物质），其上着生有大量的微生物和附生动植物，很难保持培养过程中的无菌。此外，大型海藻的细胞去壁以及植株再生相对困难，这严重影响了大型海藻的实验室培养。就大型海藻无菌株的分离而言，目前一般有吸管洗涤法、琼脂平板法、紫外线照射法以及抗生素法等，通常利用抗生素处理可获得较满意的结果；关于大型海藻以及其它一些绿藻的原生质体培养过程中的去壁问题，可根据这些藻类细胞壁成分的不同选择果胶酶、纤维素酶、溶菌酶以及多糖酶等对细胞壁加以消化；植株再生的问题相对复杂，一般认为，海藻可以通过组织培养诱导愈伤组织形成，愈伤组织可再分化形成叶状体或孢子体等，虽然有高等植物（如烟草、矮牵牛等）诱导再生条件加以参考，但是，海藻的发育是有别于高等植物的，需要对海藻的生长发育调控加以深入的研究。3.2 海洋天然产物和海洋药物的分离纯化 现已发现，在海洋生物体内存在着一些肽类和蛋白质，它们具有很高的抗肿瘤、抗菌、抗病毒以及抗凝血等活性，如：秦松等发现一种来自于蓝藻的别藻蓝蛋白具有很高的抑制)S180实体瘤活性，并可以增强荷瘤小鼠的免疫功能16；我们研究小组从鲨鱼肝脏中分离到的一种肝刺激物质17可以明显抑制乙肝病毒模型鸭血清中HBV的DNA水平，并可以显著抑制CCl4致肝损伤模型小鼠血清中ALT和AST活性，具有明显的保肝护肝功能18。 关于分离纯化蛋白的理化性质的研究，一般可采用等电聚焦电泳、变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、氨基酸组成及序列分析以及圆二色谱等方法，对蛋白质的等电点、分子量、分子组成及一级结构等进行全面的分析；对一些新型未知功能的蛋白质和多肽，还可以通过核磁共振、X-衍射及计算机辅助分析的方法，对它们进行高级结构的预测，以探讨可能的构效关系。3.3 海洋天然产物和海洋药物的大规模筛选系统 传统的药物筛选模型和药物筛选方法一般以离体器官的培养和整体动物为主，用此模型和方法进行新药筛选，准确率相对较高，已获得了不少研究成果，不可否认的是：由于该模型和方法对样品的要求量较多、且工作量很大而导致新药筛选的效率低下，成本相应过高。近年来，随着细胞培养技术、转基因动物实验技术以及生物芯片技术的发展，建立在分子和细胞水平上的高通量筛选技术已日趋成熟，因该方法具有样品用量少、工作效率高、筛选费用低廉以及可较好地反映药物作用的机制等特点。3.3.1 生物芯片生物芯片是近几年迅速发展起来的一项新技术，包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片的基本原理已有详细的报道19，用其筛选药物的基础是对一些重大疾病相关的发病机制的研究与认识，通过对生物体发病期间机体组织中细胞因子类物质、细胞膜受体及其它成分变化的研究，克隆相关基因片段，按一定的排列方式固定到芯片上，用侯选药物处理动物或细胞，将会导致动物或细胞基因表达谱的变化，掺入标记分子后，与芯片上的探针杂交，以此可以初步确定侯选药物针对某种疾病的药效学活性，如果该芯片上偶联有多种疾病相关基因的话，甚至可以在同一块芯片上检测到侯选药物的多种药效学活性。蛋白芯片的技术和原理与基因芯片类似，两者的差异仅表现在前者是在蛋白质翻译水平进行新药筛选，后者则是在基因转录水平上进行的。因此，利用芯片技术筛选药物，不仅具有高通量、大规模的特点，还可以通过对操作过程的标准化设计进行自动化药物筛选。3.3.2 基因敲除以及基因导入 基因敲除和基因导入技术是20世纪80年代后期利用基因重组技术发展起来的一门新技术，其技术基础是胚胎干细胞（ES细胞）的分离和体外培养技术，目前已广泛应用于动物病理模型和新药筛选模型的建立中。有鉴于对基因敲除和基因导入工作在疾病和新药研究中重要性的认识，目前，科技部已在国家重大基础研究项目中专门设立该项目的研究。现正在准备利用这些建立的模型对我们从海洋生物体内分离到的活性物质进行筛选。展望随着现代生物技术的迅猛发展，人类开发天然药物资源有了有力的“武器”，针对天然药物研究中存在的问题，运用包括微生物培养、细胞培养、层析技术在内的现代生化与分子生物学技术，结合基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程、生物反应器、生物芯片以及计算机辅助等技术，通过现有技术的组装，形成一套完整的针对天然药物药物研究的技术体系20，不仅可以解决长期困扰研究人员的药源困难问题，同时也是天然药物资源的开发走向有序、合理及可持续发展的必由之路。我们有理由相信天然药物的研发在新的世纪中将会取得更大的突破。参考文献：1 邓明鲁. 中国动物药资源M . 北京: 中国中医药出版社, 2007:341-345.2 李建平, 林吉吉, 邓明鲁. 中国动物药概况J . 中药研究与信息,2003, 5( 8) : 24-27.3 魏金荣, 张玉亏, 张岐山. 白眉蝮蛇降纤酶的纯化及特性分析J . 中国生化药物杂志, 2006, 27( 2) : 101-103.4 史克莉, 陈振江. 几种动物类中药材SDS-PAGE 的电泳鉴别J .中成药, 2004, 26( 5) : 411-413.5 古今, 刘萍, 冯建涌. 用高效毛细管电泳法鉴别冬虫夏草及其伪品J . 药学服务与研究, 2005, 5( 3) : 230-233.6 黄春洪, 孔毅, 吴杰连, 等. 尖吻蝮蛇毒素组双向电泳和二维液相色谱研究J . 中国药科大学学报, 2006, 37( 2) : 169-173.7 唐晓晶, 冯成强, 黄璐琦, 等. 蕲蛇及其混淆品高特异性PCR鉴别J . 药物分析杂志, 2006, 26( 2) : 152-155.8 王晶娟, 张贵君, 白根本. 蜈蚣等5 种动物类中药18SrRNA 基因酶切鉴定的初步研究J . 中国药学杂志, 2002, 37(8) : 582-584.9 段冷昕. 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