细胞培养FAQ (1).doc

细胞培养基本技术概述无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每 次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间 隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45 角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程 中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐 针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌 制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干 净，勿加清洁剂清洗。3. 灭菌 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于 oven 中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170 oC, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高 压灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟处理。 培养基 1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳， 可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合， 然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生 长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。 3.2. 材料： 3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) 3.2.2. 粉末培养基 3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 3.2.4. 电磁搅拌器 3.2.5. 无菌血清瓶 3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 3.2.7. pH meter 3.2.8. 真空帮浦 3.2.9. CO2 气体 3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后 溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。 若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时， pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养 基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 4. 配制培养基之生长测试 4.1. 材料： 4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) 4.1.3. methanol 4.1.4. glacial acetic acid 4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 4.2. 步骤： 4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35 mm TC dish) 中，每个well 接种1 102 活细胞，同时作对照组实验。 4.2.2. 接种57 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群 落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)，室温下静 置10 min。 4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室温下静置染色2-3 min。 4.2.6. 去除染液，水洗二次。 4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不 佳，则丢弃之。 抗生素 1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待 token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。 5. 抗生素使用种类与浓度： 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 血清 1. 血清必须贮存于20 -70 oC，若存放于4 oC，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加 入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 oC 或70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇 晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由20 oC 直接 至37 oC 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均 匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建 议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿将血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本 身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上 清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会 阻塞过滤膜。 6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。 有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清 放在37 oC 中欲培养此“微生物“，但在37 oC 环境下，又会使此沈淀物增多，更 会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此 小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批 号的血清。 7. 血清之生长测试 7.1. 材料： 7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish) 7.1.4. methanol 7.1.5. glacial acetic acid 7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 7.2. 步骤： 7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80 % confluency。 7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细 胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1102 活 细胞数/ ml。 7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血 清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。 7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大 到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。 7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1)，室温下静 置10 min。 7.2.6. 去除固定液，水洗二次。 7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室温下静置染色2-3 min。 7.2.8. 去除染液，水洗二次。 7.2.9. 以肉眼计数群落数 7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。 7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于70 oC 保存之 冷冻细胞活化 1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死 亡。 2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生 单株抗体或是其它蛋白质)。 3. 材料 3.1 37 oC 恒温水槽 3.2 新鲜培养基 3.3 无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 3.4 液氮或干冰容器 4. 步骤： 4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时 盖子易松掉。 4.3 将新鲜培养基置于37 C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无 菌操作台内。 4.4 取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全 部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为 1:101:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作 存活测试。 4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异， 一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞 悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清 液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。 细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞 种类而异。 2. 材料： 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于20 oC，使用前放在37 oC 水槽 回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤： 3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用数分钟，于倒 立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清 之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数 次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常 培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的 培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可 能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基 稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。 细胞计数与存活测试 1. 原理： 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。 1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形， 其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方 盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计 数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞 数目。 1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细 胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细 胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。 2. 材料： 2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.2. Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca+/Mg+ free saline 2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) 2.4. 计数器(counter) 2.5. 低倍倒立显微镜 2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步骤： 3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于 1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。 3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml *每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。 3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/24392.6 % 细胞冷冻保存 1. 注意事项： 1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 90 致密度。 1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二 日测试是否有抗体之产生。 1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以510 ml 小体积 分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽 灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 1.4. 冷冻保存之细胞浓度： 1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻 浓度太高而在解冻24 小时后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须 较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106 cells/ml。 1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保 存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 1.6. 冷冻方法： 1.6.1. 传统方法: 4 oC 10 分钟- -20 oC 30 分钟- -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜) - 液氮槽vapor phase 长期储存。 1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以1 -3 oC/分钟之速度由室温降至120 oC， 放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 2. 材料： 2.1. 生长良好之培养细胞 2.2. 新鲜培养基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球计数盘与盖玻片 2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II) 3. 步骤： 3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10 ，混合均匀，置于室温下待用。 3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细 胞浓度及冻前存活率。 3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混 合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污 染检测。 3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟 -20 oC 30 分钟 -80 oC 1618 小 时(或隔夜) 液氮槽vapor phase 长期储存。 3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序 为: program 7: HB CELL 收到细胞的处理方式 细胞活化 1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞 株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于70 C， 隔夜后， 移到liq N2)。 2. 冷冻细胞解冻程序: 2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比 例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之 血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养 基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种 类培养之。 2.3. 将培养基置于37 C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无 菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 C 水槽中快速解冻， 水面高度不可 接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全 部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。 2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask 中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混 合均匀，放入37 C，5 % CO2 培养箱培养。 2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活 化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除， 待第二天确定细胞生长或贴附良 好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需 立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中， 离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基， 将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入37 C， 5 % CO2 培养箱培养。 收到T25 flask 细胞时， 处理方式为 1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查 flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题， 不 要打开盖子，请立即通知细胞实验室。 2. 将原封之T25 flask 静置于37 C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 C， 并 让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask 内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依 一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。 细胞培养FAQ(一）如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 如何消除组织培养的污染？ 当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。 4. 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。 5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 6. 重复步骤4。 7. 在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 目录上说，Hanks 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 我试用SF900 II时，细胞生长良好，但是我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好。 如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1），让血清给蛋白酶提供作用底物。 20C下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？ 对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。 下表列出温度改变10时，PH值的变化情况： 例如 20下配制PH7.4 Tris缓冲液,40时PH值为 7.4-(2x0.310)6.78 缓冲系统 pKa/20 DeltapKa/10 Mes 6.15 -0.110 Ada 6.60 -0.110 Pipes 6.80 -0.085 Aces 6.90 -0.200 Bes 7.15 -0.160 Mops 7.20 -0.013 Tes 7.50 -0.200 Hepes 7.55 -0.140 Tricine 8.15 -0.210 Tris 8.30 -0.310 Bicine 8.35 -0.180 Glycylglycine 8.40 -0.280 室温下(25)配制的Tris-HCl溶液，在37使用时PH值是多少？ 缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4，25，37时，不同的PH值。 4C 25C 37C 8.1 7.5 7.2 8.2 7.6 7.3 8.3 7.7 7.4 8.4 7.8 7.5 8.5 7.9 7.6 8.6 8.0 7.7 8.7 8.1 7.8 8.8 8.2 7.9 8.9 8.3 8.0 9.0 8.4 8.1 9.1 8.5 8.2 9.2 8.6 8.3 9.3 8.7 8.4 9.4 8.8 8.5 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？ 生长培养基的PH值对细胞的增殖和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.06.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。 High Five细胞有任何其它名称吗？ High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别 PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。 在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？ High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。 High Five细胞用多大的密度冻存？ 3.0x10E6 cells/ml。 在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？ 可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。 如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。 胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞： 1. 去除培养基。 2. 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。 3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。 4. 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。 5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。） 6. 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。 7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？ 为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。 在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？ 通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。 Tech tips 贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。 如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。 当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 总之，大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 在进行传代培养时，我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释（14或12）进行传代，不进行活性检测，您可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞，这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。 在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。细胞培养FAQ（二）1、冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2、细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响