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实验四 植物DNA的大量提取与Southern杂交第一天一、植物DNA的大量提取CTAB法：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注:CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中。-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。材料：转基因植株步骤：1) 取20 mL CTAB提起液于50 mL离心管中，65预热。2) 取5克新鲜幼嫩叶片，加液氮磨成粉末，转入盛有预热提起液的离心管内，迅速搅拌均匀。3) 于65水浴提取1 h。冷却至室温。4) 加等体积氯仿-异戊醇（241），充分混合均匀。5) 离心（4000r/min，15分钟）。6) 上清液用等体积氯仿-异戊醇抽提1次（4000 rpm，15 min）。7) 上清液中加入2/3体积的异丙醇，摇匀。此时应有絮状DNA出现。8) 挑出DNA， 置于10 mL离心管中。加76乙醇浸泡1 h9) 离心（3000 g，4）15 min10) 沉淀DNA用76%乙醇洗2次，自然晾干11) 沉淀加入5 mL 1 mol/L pH8.0 TE buffer，5 L RNase A（1.0 mg/ mL），56温浴至全部溶解12) 加入预冷的等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，摇匀，4C静置10 min，离心(3000 g, 20 min)13) 上清液加入1/10体积5 mol/L NaAc，2倍体积乙醇，-20oC放置1 h或过夜。14) 离心(12000 g, 20 min)，沉淀用75%洗2次15) 转移至95的乙醇中，浸泡5 min16) 将DNA自然晾干，溶于1 mol/L pH8.0的TE溶液中，贮于4待用。第二天二、DNA浓度的测定及调整待DNA完全溶解后，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量。取2 L DNA 溶液加98 L H2O，混合。取5L 进行琼脂糖凝胶电泳，以/Hind III为标准，凝胶扫描后估算DNA含量。通过稀释将DNA浓度调至250300 ng/L左右。三、 DNA的酶切、电泳、Southern转移1. 浓度调至250300 ng/L的DNA用常见的限制性内切酶（EcoRI）进行酶切，取总DNA 2.5-3 g，8U 的限制性内切酶，特异的酶切缓冲液1.7 L，用ddH2O使总体积为17 L，37酶切过夜。Pst/EcoR/BamH样品编号内切酶Buffer类型17 L反应体系中各成分用量（L）DNABufferenzymeRNaseH2OTotal1EcoR I31.70.517第三天2. 取2 L 酶切反应混合液进行电泳检测，3. 当酶切完全后进行酶切片段的电泳分离。电泳时琼脂糖浓度为0.8，电压40V，待溴酚蓝指示带到达前缘后停止电泳。4. 转膜1) 用0.2 mol/L HCl变性8分钟，2) 用0.4 mol/L NaOH 作转移液将凝胶中的酶切片段通过虹吸作用转移至Hybond N尼龙膜上（约需24 h）。第四天3) 将膜用2SSC洗2次，每次5 min，置于干净滤纸上晾干，晾干的膜于已预热至85左右的干燥箱中烘干（约3 h），或紫外照射3 min。保存于4备用。四、Southern杂交原理North2South生物素标记和化学发光检测Kit采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dCTP掺入到合成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性DNA探针。杂交洗膜后，DNA上的生物素与链亲和素标记的HRP结合，最后与Pierce 的化学发光底物发光检测，灵敏度可以与32P相媲美。 步骤：1）预杂交在65水浴中预热杂交液，将准备好的膜置于杂交盒中，加入预热的杂交液 10 mL（将膜完全淹没，每平方厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65外，其他的都用55），盖好盖子，置于55杂交箱中预杂交1 h。2）探针准备：A 将1 L生物素标记的N4-dCTP与4 L的5dNTP混合物充分混合备用（总量5 L）；B 在离心管中稀释约50 ng线性探针模板至12 L；C 加入5 L随机引物于上述离心管中，煮沸变性5 min，迅速在冰水混合物退火5 min；D 加入5 L N4-dCTP与5dNTP的混合物，2.5 L反应缓冲液，0.5 L Klenow酶片断，混匀；E 37 孵育60 min；F 加入1 L EDTA以灭活Klenow酶活性，-20 保存备用。G 热变性探针：21L探针煮沸变性10 min，迅速在冰/盐水混合物退火5-10 min。（每毫升杂交液加1-1.5L探针，或探针浓度约30ng/mL杂交液）；3）杂交：将标记好的探针加入杂交盒中，55杂交过夜（4小时以上，过夜）。第四天4）洗膜：A 0.5严谨洗膜缓冲液配制（0.2 mL/cm2膜）：2North2South Hybridization Stringency wash Buffer(平衡严谨洗膜缓冲液)室温（25 以上）充分溶解，加入3倍体积去离子水配置所需洗膜液；B 将膜转移到一个新的杂交盒中。加入0.5严谨洗膜液（0.2 mL/cm2膜），55 旋转洗膜3次，每次20 min。5）信号检测A 预先缓慢温浴封闭液和4漂洗缓冲液（37-50 ）溶解，此2种缓冲液可以在室温使用，底物平衡液可以在室温使用，要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒；B 配制1漂洗缓冲液120 mL（1:3配比）；C 封闭：弃严谨洗膜液，加入封闭液（0.25 mL/cm2膜），45 振荡洗膜封闭15 min（37-50 均可）；D 抗体稀释液配制（1:300）：66.7 L稳定的链亲和素标记的HRP(SSHP) 20 mL封闭液；E 抗体孵育：弃封闭液，加入20 mL 抗体稀释液，室温轻柔振荡孵育15 min；F 洗膜：用20 mL的1漂洗缓冲液淋洗杂交膜，然后再用20 mL漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗4次，每次5 min；G 平衡：将杂交膜转移到一新的杂交盒，用30 mL的底物平衡液室温轻柔振荡孵育5 min；H 底物工作液配置：North2SouthTM Luminol/Enhanser溶液和North2SouthTM过氧化物酶稳定溶液1:1等体积混合，底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜(约0.1 mL/cm2)；注：该工作溶液在室温下至少能稳定6 h。I 底物孵育：把湿润的膜放在一个干净的杂交盒里，与North2SouthTM底物工作溶液在室温下暗室孵育5 min。确保膜被底物溶液完全淹没或覆盖；J 把湿润的膜转