核酸的组成和分类.doc

Alexendra整理 2007-6-15 生化核酸部分复习提纲核酸的组成和分类 核酸的基本结构单位是核苷酸，核苷酸由核苷和磷酸组成，核苷由碱基和戊糖组成。DNA中戊糖为D-2-脱氧核糖(D-2-deoxyribose)，碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶；RNA中戊糖为D-核糖(D-ribose)，碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。碱基和戊糖的化学结构组成核酸的碱基主要为嘌呤衍生物和嘧啶衍生物，核酸中的嘌呤衍生物都是腺嘌呤和鸟嘌呤。嘌呤碱基由母体化合物嘌呤衍生而来。嘧啶碱基是母体化合物嘧啶的衍生物，DNA：嘧啶衍生物为胞嘧啶和胸腺嘧啶，RNA：嘧啶碱为胞嘧啶和尿嘧啶，但tRNA中含有少量胸腺嘧啶核酸中还发现一些修饰碱基，也称稀有碱基，它们绝大部分也都是嘌呤和嘧啶类化合物。稀有碱基含量很少，种类却很多，以甲基化的碱基居多。核酸中，tRNA含稀有碱基最多，含量可高达10。（自己画结构）DNARNA尿嘧啶（U）5羟甲基尿嘧啶（hm5U）5甲基胞嘧啶（m5C）5羟甲基胞嘧啶（hm5C）N6甲基腺嘌呤（m6A）5,6-二氢尿嘧啶（DHU）5甲基尿嘧啶，即胸腺嘧啶 (T)4硫尿嘧啶（s4U）5甲氧基尿嘧啶（mo5U）N4-乙酰基胞嘧啶（ac4C）2-硫胞嘧啶（s2C）1甲基腺嘌呤（m1A）N6,N6-二甲基腺嘌呤（m26A）N6-异戊烯基腺嘌呤（iA）1甲基鸟嘌呤（m1G）N1,N2,N7-三甲基鸟嘌呤(m32，2，7G)次黄嘌呤（I）1甲基次黄嘌呤（m1I）核酸根据戊糖的种类分类，构成DNA的戊糖是D-2-脱氧核糖，RNA链的戊糖是D-核糖。此外, 还发现有D-2-O-甲基核糖。糖环上的C原子编号为1，2，3，4，5。核苷戊糖与碱基缩合而成的化合物称为核苷。 1、核苷的分类 按照戊糖种类的不同：核糖核苷，脱氧核糖核苷，2-O-甲基核苷；按照碱基的不同：嘌呤核苷和嘧啶核苷2、核苷的结构特点 核苷结构中糖基与碱基以-糖苷键相连，称为N-糖苷键，核苷中戊糖均为呋喃型环状结构。在空间结构上碱基与糖环平面互相垂直，在DNA双螺旋中碱基配对是以反式定位的，碱基上的氨基或酮基可以互变异构为亚氨基或烯醇基。不同pH条件下核苷有不同的解离态。核苷酸 1、种类 核苷的磷酸酯叫核苷酸，分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。核糖核苷的戊糖分别可形成 2 、3、5三种核苷酸；脱氧核糖核苷只能形成3和5-核苷酸；2-O-甲基核苷也只有两种核苷酸。生物体内存在的游离核苷酸多以5形式存在，碱水解RNA时，可得到2,3核糖核苷酸的混合物。 2、核苷酸的结构 3、多磷酸核苷酸 核苷中戊糖的羟基被一个磷酸单酯化，称单磷酸核苷酸或单磷酸酯，核苷还有二磷酸酯和三磷酸酯。细胞中含有少量游离存在的多磷酸核苷酸，它们既可以作为核酸合成的前体，也可以是生物体内的辅酶或能量载体。（ATP）4、环核苷酸 在细胞中的含量很低，却有极重要的生理功能，在细胞内往往作为重要的调节分子和信号分子，常被称之为“第二信使”。常见的环核苷酸有3,5-环化腺苷酸（cAMP）和3,5-环化鸟苷酸（cGMP）核酸分子的结构及表示方法 1、结构 核酸是由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接而成的线性分子 2、表示方法 1）碱基表示法 ademine：Ade; thymine：Thy一般不使用碱基符号 2）核苷的表示法核苷一般以单字母表示，A、G、C、U，脱氧核苷以dA, dG, dC, dT表示；修饰成分的表示方法是在缩写符号左面以小写英文字母和数字注明取代基种类、数目和位置。例如：m26A：即N6,N6二甲基腺苷；m32,2,7G：即N2,N2,N7三甲基鸟苷3) 核苷酸的表示法 核苷符号左方的小写字母p，表示5-磷酸酯，核苷符号右方的小写字母p，表示3-磷酸酯。如pA：5-腺苷酸，Cp：3-胞苷酸。多磷酸酯以小写字母p的数目表示，ppU；pppA；ppGpp：鸟苷四磷酸，3,5-环化核苷酸书写为cAMP，cGMP等。4）核酸链的表示法 从左向右从5端写至3端 (5)pApGpC pUpC(3)， AGC UC，AGC UC竖线表示核酸的戊糖碳链，A、G、C、T表示碱基，p代表磷酸基，p引出的斜线一端与C3相连,另一端与C5相连DNA分子的碱基组成 1、A = T、G = C ，A + G = T + C 2、DNA的碱基组成具有特异性 不同物种的DNA有自己独特的碱基组成，同一物种的DNA没有组织和器官的特异性，也不随年龄、环境和营养状态变化DNA的一级结构DNA的一级结构就是核苷酸在DNA分子中的排列顺序。DNA是由A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接起来的直线型或环型多聚体，DNA也是一种生物高分子。生命信息绝大部分贮存在DNA分子中，以核苷酸不同的排列顺序编码在DNA分子上，核苷酸排列顺序变了，其生物学含义也就不同了。DNA分子结构无支链。DNA的二级结构1、双螺旋结构的基本特征 1）主链 两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴以右手螺旋相互盘绕而成。多核苷酸链的方向习惯上以C3C5为正向，磷酸核糖处于螺旋外侧，是亲水性的，糖环平面与中心轴平行。 2）碱基对 由于几何形状的限制，只有嘧啶和嘌呤配对形成的碱基对才能合适地安置在双螺旋内，碱基位于双螺旋内侧，碱基平面与中心轴垂直，两条核苷酸链依靠碱基之间的氢键维系。碱基之间的疏水作用可导致碱基堆积，碱基堆积力和碱基对之间的氢键共同稳定了双螺旋结构。碱基互补原则：A与T配对，形成两个氢键，G与C配对，形成三个氢键。该原则是DNA复制、转录等的分子基础。3）大沟和小沟 双螺旋表面有两条螺形凹沟，一条深，一条浅，深的称大沟，宽1.2nm，深0.8nm，浅的称小沟，宽0.6nm，深0.75nm 4）结构 双螺旋平均直径为2nm，相邻碱基对之间的距离，也称碱基堆积。距离是0.34nm，相邻碱基之间的夹角为36O，每10个核苷酸形成一个螺旋，螺距3.4nm。实际的DNA分子平均每一螺周含10.4个碱基对，二个配对碱基不在同一平面，而是扭曲成螺旋浆状，以提高碱基堆积力，使DNA结构更稳定。2、双螺旋结构的类型 1）B-DNA 相对湿度为92% 时得到的DNA钠盐纤维，这种DNA称B型DNA，生物体内天然状态的DNA几乎都以B-DNA形式存在。以上讨论的双螺旋特征均为B型双螺旋。 2）A-DNA 当DNA钠盐（或钾盐、铯盐）在相对湿度75%时，DNA就处于A型构象。A-DNA也是由两条反向的多核苷酸链组成的双螺旋，也为右手螺旋，但螺体宽而短，碱基平面与螺旋轴有19 O的倾角，上下两个碱基相差2.56，二个相邻碱基的夹角是32.7 O，螺距为28。RNA分子的双螺旋区及RNA-DNA杂交双链的结构类似于A-DNA。A型和B型结构是DNA分子的2个基本双螺旋形式，A型结构的螺旋比B型螺旋更紧，碱基倾角更大，大沟的深度比小沟深得多。 3）Z-DNA 自然界中还有一种Z-DNA，为左手螺旋，所以它也称左旋DNA。B-DNA与Z-DNA之间可以互变3、三螺旋DNA 在三股螺旋中，通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合，第三股核苷酸链与寡嘌呤核苷酸之间为同向平行，第三股链的碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱基形成Hoogsteen氢键。三股螺旋中的第三股既可以来自分子间，也可以来自分子内。比如，当DNA的一段多聚嘧啶核苷酸或多聚嘌呤核苷酸组成镜像重复（即H-回文结构），就可以回折产生三螺旋结构。DNA的三级结构DNA的三级结构指DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用，单链与二级结构的相互作用以及DNA的拓扑特征。环状DNA：生物体内有些DNA分子以双链环型DNA形式存在，如细菌染色体DNA，质粒DNA，细胞器DNA等。正常的DNA分子处于能量最低状态，如果将正常的双螺旋拧紧或拧松，分子会产生额外张力。若双螺旋末端是开放的，张力可以通过链的转动而释放，如果末端被固定或形成环状分子，张力只能在内部消化，即DNA内部原子的位置会重排，导致分子扭曲以抵消张力，这种扭曲就称为超螺旋。超螺旋是DNA三级结构的一种形式。天然DNA分子的超螺旋一般为负超螺旋，超螺旋的DNA结构比较紧密，密度较大，在离心场中移动较快，在电泳中泳动的速度也比较快，应用超离心及凝胶电泳可以分离不同构象的DNA。DNA分子的一些重要特性 1、DNA分子的长度 大肠杆菌染色体DNAbp:4106,MW:2.6109,长度:1.4106nm; （L/D7*105）;人类DNA分子bp:3.2109,长度约1米（L/D108）。极易受机械力的影响而降解。 2、DNA分子的稳定性 DNA在生理状态下十分稳定，维持这种稳定性的主要因素是氢键和碱基堆积力。氢键：GC A-T，碱基堆积力：相邻两个螺旋间碱基的电子之间可以产生堆积。DNA的碱基集中在双螺旋内侧，层层堆积起来的碱基在螺旋内形成了强大的疏水区，使之与介质中的水分子隔开。维持DNA分子稳定性的其它因素还有正负电荷之间的静电引力和范德华力。（介质中的阳离子与核苷酸中的PO4-3） 3、DNA分子的可塑性 由于热力学作用，在溶液中，DNA骨架上的共价键转角会改变，引起DNA分子的弯曲，缠绕或伸展。 4、DNA分子结构中的碱基互变异构体 DNA的化学性质与碱基上的氢原子位置有关，碱基上的氢原子具有较固定的位置, A和C上的氮原子基本上是以NH2形式存在，只有少数亚胺基；同样G和T上的氧常常是酮式，很少有烯醇式。这一现象具有极重要的生物学意义,它是碱基互补原则、双螺旋结构、DNA复制乃至遗传学的基础。互变异构偶尔会发生，极端情况下碱基会有不同的解离态，这是DNA突变的原因之一，也会导致生物的进化RNA分子的组成及二级结构 1、RNA的组成 RNA的组成与DNA类似，也由四种核糖核苷酸组成：腺嘌呤核糖核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸，胞嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸。与DNA相比，核糖核苷酸中，核糖替代了脱氧核糖，尿嘧啶取代了胸腺嘧啶。RNA组成上的另一个特点是存在稀有碱基，尤其是tRNA中稀有碱基为数较多。 2、RNA的二级结构 RNA分子中核苷酸的戊糖是核糖，而不是脱氧核糖。RNA是核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的线性分子，并且分子中磷酸二酯键是通过3,5-连接的，而不是2,5-的连接。与DNA类似，RNA也是无分支结构。天然RNA不象DNA那么规整，它是单链线性分子，只有局部区域通过分子的自身回折使碱基互补，形成氢键，从而形成双螺旋结构。双螺旋区至少由4-6个碱基对形成，结构为A-DNA型。双螺旋区约占RNA分子的一半。RNA的类型任何生物体都存在三种主要的RNA，mRNA，tRNA，rRNA。mRNA负责接受DNA分子的遗传密码信息（即蛋白质中氨基酸排列顺序），并以自身为模板合成蛋白质。tRNA 在蛋白质生物合成过程中负责接受、转运和掺入氨基酸。rRNA是构成核糖体的重要成分，而核糖体是蛋白质生物合成的场所。绝大多数RNA分子是在细胞核内合成的。核内存在着各种前体RNA，都是由细胞核DNA转录产生的，它们的分子量往往很大，必须经过剪切，装配和修饰等一系列加工过程才能产生成熟的RNA，进入细胞质中行使生物学功能。上述三种存在于细胞质中发挥作用的RNA都称为“成熟RNA” 1、tRNA1）tRNA的特征 A.含7393个核苷酸,分子量约为25000,沉降系数为4SB.稀有碱基较多，近50种稀有碱基存在于tRNA，每个tRNA分子至少有219个修饰碱基，可达碱基总数的1015%.稀有碱基的作用是提高tRNA与 rRNA和蛋白质等特定分子的识别能力，并增强疏水作用.C.3末瑞(接受末端)：CPCPA-OH作用：接受活化的氨基酸D.5末端：pG.或 pC.E.二级结构均呈三叶草形,叶柄：双螺旋区,叶子：突环区,F.三级结构象倒L形2）tRNA的二级结构tRNA的二级结构中，双螺旋区比例较大，结构很稳定.氨基酸臂：含7个bp,富含G,末端为CCA,接受活化的氨基酸。二氢尿嘧啶环：由8-12个核苷酸组成，其中含2个二氢尿嘧啶。通过二氢尿嘧啶臂（3-4bp组成的双螺旋区）与tRNA分子的其余部分相连。反密码环：含7个碱基，环中部三个碱基是反密码子，可以识别mRNA的密码子。反密码环通过反密码臂（5 bp组成的双螺旋区）与tRNA其余部分相连。额外环：含3-18个核苷酸。不同的tRNA，额外环大小不同，所以该环可以作为 tRNA 的分类标志。假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环TC loop：7个核苷酸通过由5对碱基对组成的TC臂与tRNA的其余部分相连。绝大多数tRNA在此环中都含有TC，大多数tRNA的第54-56位存在TC序列。它对于tRNA分子与5S rRNA的结合和tRNA高级结构的维系有重要作用。假尿苷，是目前确定的糖苷键连接方式唯一与众不同的核苷，它是由嘧啶环的C5与核糖的C1形成糖苷键。3）tRNA的三级结构tRNA的生物功能与三级结构密切相关。2、mRNA mRNA占细胞RNA总量的3-5%，不同的mRNA长度不同，分子量变化很大，平均分子量约500000，沉降系数8S。细胞内mRNA种类繁多，因为每一种多肽都有一种特定的mRNA编码。原核生物mRNA为多顺反子结构，即一条mRNA链上有多个编码区，它以操纵子为转录单位，3和 5末端都有一段非翻译区，并且原核生物的mRNA无修饰碱基。真核细胞mRNA的结构特点 1）3-末端Poly A结构 长约20250个核苷酸 2）5- 末端帽子（cap）结构作用：抗5- 核酸外切酶的酶解，保证翻译活性协助核糖体识别并结合mRNA，使翻译从AUG起始密码子处开始，保证蛋白质合成的正确性 3）编码区和非编码区 mRNA的编码区是所有mRNA分子的主要结构部分，编码区包含蛋白质的信息，编码特定的蛋白质分子。三联体密码在所有生物中通用。无论原核还是真核生物的mRNA都存在5端和3端两个非编码区，非编码区常常含有起调控作用的区域。游离的mRNA可以有高级结构，但翻译时必须首先解开高级结构，所以mRNA形成高级结构后不利于翻译进行。3、rRNArRNA在细胞RNA中含量最大，约占80%， rRNA构成核糖体的骨架，并可与mRNA和tRNA相互作用，促进蛋白质的合成，近年来的研究证明，rRNA能够催化肽键的形成。原核细胞中有三类rRNA：5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA；真核细胞中有四类rRNA：5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。核酸的紫外吸收1、核酸具有紫外吸收 吸收范围：240-290 nm，max =260nm，利用核苷酸的吸收特性可以定量测定核苷酸。2、根据紫外吸收判断样品纯度对于纯的核酸分子或寡核苷酸，测定光吸收值A260，可以估算样品的含量。A =1：50g/ml双螺旋DNA或40g/ml单链DNA(或RNA)或20g/ml寡核苷酸。纯的核酸样品的A260/A280的比值基本为一固定值纯的DNA：1.8，纯的RNA：2.0。核酸常常与蛋白质混合在一起，当样品混含杂蛋白时，该比值会明显降低（因为蛋白质的最大吸收在280nm）。3、用摩尔磷消光系数(p)表示溶液中核酸核酸分子中碱基和磷原子含量相等，可以用P的含量来表示核酸的含量。(p) = A/CL = 30.98A/WL，其中A：光吸收值，C：磷的摩尔浓度，L：比色杯内径，W：每升溶液中磷的重量（g）。天然DNA的(P)为6600，RNA为7700-7800。核酸的(P)比核苷酸单体低，单链多核苷酸的(P)比双螺旋多核苷酸的(P)要高。增色效应：核酸变性时，(P)增加；减色效应：当核酸复性时，(P)降低。核酸的变性、复性及杂交（一）、变性 1、变性和降解 DNA的变性过程是双螺旋结构被破坏，物化性质发生改变的过程。核酸的变性指核酸分子双螺旋区的氢键断裂，双链解体成单链，其间不涉及共价键的断裂。 核酸的降解指多核苷酸骨架上共价键的断裂，因而引起核酸分子量的降低。氢键的破坏导致变性，共价键的破坏导致降解 2、变性DNA物化性质的改变 1）粘度大大降低2）沉降速度提高3）浮力密度增大4）260nm处的紫外吸收增加5）比旋下降6）酸碱滴定曲线改变。DNA会部分甚至全部失去生物活性 3、影响核酸变性的因素 热变性：提高温度破坏双螺旋区的氢键 酸碱变性：改变溶液pH值，导致氢键和疏水相互作用被破坏 化学试剂变性：有机溶剂、尿素、甲醛可以破坏疏水相互作用 4、DNA的熔解温度Tm DNA变性的特点是爆发式的，即变性作用发生在很窄的温度区间。当温度提高到某一个温度范围，DNA突然变性。在温度提高的过程中，以温度对紫外吸收作图，会得到一条S形曲线DNA的变性曲线。DNA的熔点Tm (熔解温度)：通过加热使DNA的双螺旋结构解旋50时的温度，DNA的Tm一般在82 - 95之间。影响Tm值的因素：）DNA的均一性：均一性愈高，熔点范围越窄）G-C bp含量：含量越高，Tm越高。G-C %=（Tm 69.3） 2.44 )介质的离子强度：在低离子强度介质中，DNA的Tm下降，熔解温度范围较宽，而在离子强度较高的介质中，DNA的Tm较高，熔解温度范围较窄。 5、RNA的变性 RNA也会发生变性，但RNA的Tm较低，变性曲线较宽，然而tRNA因为双螺旋区较大，因此Tm较高；而双链RNA的变性与DNA相同。（二）、复性复性：在适当条件下，变性DNA的两条链重新缔合成双螺旋结构的过程。复性后，DNA的物化性质得以恢复，生物活性也可部分或全部恢复。DNA复性的影响因素1、降温速度 退火：变性DNA缓慢冷却而复性的过程 2、DNA片段的大小 3、DNA的浓度 4、核苷酸顺序的复杂程度（三）、核酸的杂交若将异源DNA一起变性，如果它们之间有部分序列相同，复性时会形成杂交分子。 DNA分子间可以杂交，DNA与互补RNA也可以杂交。核酸的杂交是分子生物学和分子遗传学等研究中的重要手段。核酸的杂交既可以在液相进行，也可以在固相进行，实验室应用比较广泛的杂交方法是在硝酸纤维素膜上进行的。DNA酶解电泳变性转移烘烤杂交洗涤放射自显影核酸的酸碱性质1酸碱性质 核苷酸分子结构中的磷酸基团具有较强的酸性，它的H+极易解离，所以核酸具有相对强的酸性，核酸可视为多元酸。碱基的稳定性很大程度上依赖于氢键，氢键与碱基的解离状态有关，所以溶液的pH直接影响着双螺旋结构乃至核酸的稳定。核酸分子中既有酸性基团，又有碱性基团，核酸也是两性电解质，它在不同pH溶液中的解离程度不同。两性解离导致兼性离子的形成，所以核酸也有等电点。2核酸的水解酸水解：核酸分子的糖苷键和磷酸二酯键都可以被酸水解，其中糖苷键对酸更不稳定。嘌呤碱基的糖苷键比嘧啶碱基更易水解，而脱氧核糖与嘌呤碱基形成的糖苷键最不稳定。所以DNA在pH 1.6于37对水透析就可以脱嘌呤，得到无嘌呤酸。碱水解：DNA的磷酸酯比较稳定，RNA的2- OH在碱性条件下，与3-位磷酸酯中的游离羟基形成不稳定的磷酸酯，随即链间的磷酸酯键断裂，产生2,3- 环磷酸酯，继而产生2- 核苷酸和3- 核苷酸酶水解：非特异性水解磷酸二酯键的酶称磷酸二酯酶，特异性水解核酸的磷酸二酯酶叫核酸酶。核酸内切酶：水解分子内磷酸二酯键，核酸外切酶：从核酸链的一端逐个水解核苷酸。非特异性的磷酸单酯酶对一切核苷酸都能作用，特异性的酶如 3- 核苷酸酶或5-核苷酸酶，只能分别水解3-核苷酸或5-核苷酸。核酸的分离与纯化1RNA的分离 RNA的分离比DNA复杂，因为RNA分子不稳定，更困难的是环境中到处存在 RNase，很容易降解RNA，所以提取RNA时必须注意破坏RNase的活性。2凝胶电泳凝胶电泳 简单，快速，分离效果比其它方法好得多，无论大小分子都能很好地被分离。凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖于它们的分子量及分子构型，而凝胶的类型及其浓度对被分离核酸的分子大小关系重大。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电荷作用的双重分离效果，分离效率很高。琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)琼脂糖浓度：2.5 0.1%，分离片段大小：51045108 D，用于分析DNA较好，分析RNA时易降解，必须加入蛋白质变性剂。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）胶的浓度：24 2.4 %分离片段大小：3.31021106 D，PAGE可分析小于1000个碱基对的DNA片段和RNA。影响电泳迁移率的因素1）核酸分子大小：迁移率与分子量对数成反比2）DNA的构象：超螺旋DNA迁移最快，线型DNA次之，开环DNA最慢3）胶浓度：迁移率与胶浓度成反比4）电压或电流：在一定的电压范围内，电泳迁移率与电压或电流大小成正比5）碱基组成：有一定影响，但不大6）温度：430，常为室温DNA的固相合成之化学合成步骤第一步：酸化 detritylation一般5-OH常用的保护基是DMT、MMT 等(di or monomethoxy trityl)，它们在酸性条件下极易脱去，此步的目的就是脱保护，使 5-OH 游离出来，进行下一步反应第二步：偶合 coupling这一步是链的延长步骤，也是合成中最关键的一步第三步：保护 capping目的是封闭任何未参与反应的5-OH。此步非常重要，不能省略。Capping试剂常用乙酸酐。第四步是氧化oxidation偶合后的产物是亚磷酸酯，必须氧化成稳定的磷酸三酯。以上四步完成了一个循环，合成了一个核苷酸，然后进入下一个循环，每循环一次增加一个核苷酸，如此往复多个周期，直至链延伸完成得到的粗产品用EtOHNH3H2O处理，可将核酸链从载体上脱落，许多保护基也同时脱去。产物用电泳或/和HPLC纯化，得到的DNA纯品可以进行各种生物学研究 聚合酶链反应（PCR）聚合酶链反应(polymerase chain reaction)是体外快速扩增DNA的一种生物技术，是一种无细胞复杂克隆法。基本原理：与DNA在生物体内的复制相仿，但它无法模拟体内的复制叉，因而需要将DNA变性，使双链分开，利用单链DNA与引物在退火过程中的杂交产生3游离羟基，然后在DNA聚合酶作用下，以dNTP 为底物，合成模版链的互补链。PCR技术操作简便，扩增效率极高，并且没有序列要求，可用于扩增任意的DNA片段。基本步骤：1、设计合适的引物 使目标DNA 的扩增行之有效，并最大限度地减少非特异产物。引物设计的原则：1）引物长度应大于16个核苷酸2）引物与靶序列间的Tm值553）引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列4）3引物和5引物之间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列5）引物中碱基的分布要尽可能均匀，G + C含量接近502、优化反应条件 包括模板、引物、 dNTP、DNA聚合酶和Mg2，PCR中常用的聚合酶是Taq DNA聚合酶3、选择热循环温度 PCR 过程的温度控制十分关键。热循环温度的选择包括反应开始时的变性温度，退火温度（一般低于引物Tm值的2-3），延伸温度等。4、检测扩增结果 一般使用电泳的方法检测结果。PCR技术非常灵敏，甚至可以检测到单拷贝基因，在临床医学检验、法医学和刑侦鉴定以及分子生物学各项研究中应用极广DNA测序（Sanger法）原理：利用待测DNA单链作模板，加入适当的引物，在DNA聚合酶催化下，在四种脱氧核糖核苷三磷酸和Mg2存在下，合成DNA片断，再利用2,3- 双脱氧核苷三磷酸使DNA合成终止于某一特定的碱基，可以得到末端终止于某特定碱基的各种不同长度的DNA片段，最后进行电泳和放射自显影，读出碱基顺序。加减法：末端终止法（常用、自动化）：2,3- ddNTP的作用是终止链的延伸。四组反应将分别得到终止于A、G、C、T的长度不同的产物，然后将四组片段分别进行电泳和放射自显影，根据不同的迁移率，可以完整地读出合成链的DNA序列，而这条合成链的互补链就是待测DNA的核苷酸顺序。DNA的限制酶图谱1、修饰和限制现象 50年代初发现微生物有修饰和限制现象，这是细菌的自卫方式之一。如E.coli K株繁殖出来的噬菌体入（K）只能感染E.coli K株，而不感染E.Coli B株，该现象称“限制”现象。然而被限制的噬菌体群体中也可能有极少的幸存个体，这些个体可以在受限制的菌株中繁衍子代。此现象称“修饰”。细菌内有二种不同功能的酶限制性内切酶：识别并切开DNA的某特定碱基序列；修饰酶甲基化酶：识别限制酶识别的碱基顺序并将其甲基化。被甲基化了的DNA不会被限制酶降解，所以细菌不会被自身的酶降解。而当异源DNA没有侵入细菌，就会被限制酶降解2、限制性内切酶发现：1968年，于大肠杆菌(E. Coli K)，来源：主要在细菌和霉菌中，特点：专一性非常强，具有严格的碱基序列专一性，能识别DNA的特定位点。（以下内容看书吧，ppt上的不可编辑，郁闷死我了）核酸和核苷酸的分解代谢1、核苷酸的降解核苷酸经磷酸单酯酶或核苷酸酶催化可水解为核苷，非特异性的磷酸单酯酶对一切核苷酸都能作用，某些特异性强的磷酸单酯酶只能水解3-核苷酸或5-核苷酸，则分别称为3-核苷酸酶或5-核苷酸酶。有两类酶可以催化分解核苷，核苷+磷酸在核苷磷酸化酶作用下分解为嘌呤碱或嘧啶碱+戊糖-1-磷酸，该酶所催化的反应是可逆的；核苷+水在核苷水解酶作用下分解为嘌呤碱或嘧啶碱+戊糖，该酶只能对核糖核苷作用，对脱氧核糖核苷无作用。 2、嘌呤碱的分解 3、嘧啶碱的分解核苷酸的生物合成 1、从头合成途径 2、补救途径（一）、嘌呤核糖核苷酸的合成、嘌呤核糖核苷酸的从头合成途径 1、次黄嘌呤核苷酸的合成 2、腺嘌呤核苷酸的合成 3、鸟嘌呤核苷酸的合成、嘌呤核苷酸合成的补救途径 1 第一条补救途径 2、第二条补救途径、嘌呤核苷酸生物合成的调节 1、产物的反馈抑制（二）、嘧啶核糖核苷酸的生物合成 1、从头合成途径 2、补救途径（三）、脱氧核糖核苷酸的合成 1 核糖核苷酸的还原 2 胸腺嘧啶核苷酸的合成DNA的复制 复制（replication）：以DNA分子为模板合成出相同分子的过程。转录（transcription）：以DNA分子为模板，合成出具有互补核苷酸顺序的RNA的过程。翻译（translation）：在RNA指导下，根据三联体密码规则合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质的过程。三联体密码规则（triplet code）：核酸链上每三个核苷酸决定一个氨基酸。某些情况下，RNA也可以携带遗传信息，如病毒RNA能以自身为模板进行复制，致癌RNA病毒还能通过逆转录（reverse transcription）的方式将遗传信息传递给DNA（一）、DNA的半保留复制模板链：能提供合成一条互补链所需要的精确信息的核酸链。双链DNA的两条链互为模板链。DNA复制时，原来的分子被分成二个亚单位，分别构成子代分子的一半，经多代复制后，这些亚单位仍保持完整。DNA经多代复制仍可保持亚单位的完整是代谢稳定性的表现，符合DNA作为遗传物质的要求，也是生物体利用半保留机制复制DNA的原因之一。单链DNA分子复制时通常也要先形成双链的复制形式。由此可见，碱基配对是核酸分子间传递信息的结构基础。（二）、DNA复制的起点和方向 1、复制子和复制叉复制子（replicon）：基因组能够独立进行复制的单位。复制子含有控制复制起始的起点，可能还有终止复制的终点。复制的控制只表现在起始阶段，一旦复制开始，就会继续下去，直至复制子完成复制。复制叉：新DNA的合成与亲代DNA的解链在同一部位同时进行，使得DNA复制生长点处形状为叉形，称为复制叉。复制方向如果为双向，则有两个复制叉或者生长点，如果是单向的，则只有一个复制叉或者生长点。 2、复制的起点和方式原核生物DNA的复制 起始位置：固定，复制起始点：一个，复制方向：双向(多数），单向二条链的复制一般是对称的，同时进行复制，有些则不对称，待一条链复制后再进行另一条链的复制；环状DNA在复制叉处解链，各自合成互补链，在电子显微镜下可以看到形如眼形的型结构。真核生物的复制 起始位置：特定，复制方向：单向、双向，复制起点：多个真核生物染色体DNA是线性双链分子，是多复制子（multireplicon）。染色体DNA的复制双向且对称，但也有例外：不对称双向复制：两个复制叉移动距离不同，如质粒R6K；单向复制：复制叉只向一个方向移动；滚动环式：噬菌体X174DNA，环状单链分子；取代环或D-环（Dloop）方式特点：两条链的复制起点间隔一定距离，两条链的合成高度不对称。复制时一条链先复制，待其复制到某一位置暴露出另一链的复制起点，另一链才开始复制。（三）、DNA聚合酶和相关酶 1.DNA聚合反应的特点1）以dNTP为底物，dNTP提供碱基和能量；2）接受模板的指导，只有当进入的碱基能与模板形成Watson-Crick碱基对时，dNTP才能加入；3)需要引物3-OH的存在；4）链生长方向为53；5)产物DNA的性质与模板相同；并且只取决于模板分子，与聚合酶及底物的比例无关 2.大肠杆菌DNA聚合酶大肠杆菌共有5种不同的聚合酶，称为DNA聚合酶、。1） DNA聚合酶 (Kornberg酶，1956），分子量103000，单一肽链，含有一个Zn原子，形状类似球体。在37下，一分子DNA聚合酶每分钟可以催化约1000个核苷酸聚合。DNA聚合酶是个多功能酶，可以表现出多种酶活性：)DNA聚合酶活性；)35核酸外切酶活性；)53核酸外切酶活性(双链）；)从3端使DNA链发生焦磷酸解；)无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷三磷酸之间的焦磷酸基交换。DNA聚合酶的35外切酶活性具有核对功能，对保持DNA复制的忠实性具有十分重要的意义。DNA聚合酶大都具有这一活性。只有极低的碱基错配率才能保证DNA复制的忠实性。DNA复制中的双重校对第一次校对：聚合酶的选择作用 聚合酶接受模板指令，通过自身的立体化学结构识别并选择正确的底物，只有满足聚合酶构象的底物才能被酶催化进行聚合反应，这一专一性的校对作用保证了掺入核苷酸的错误率仅为105第二次校对：35外切酶活性 只作用于DNA的3末端核苷酸，不能作用于双链DNA和正常生长的链，只有出现错配时，生长链的3末端才会落入35外切酶的活性位点，使错配碱基立即被清除，35外切酶的核对作用可使错配率再降低两个数量级。2） DNA聚合酶和（Kornberg T.和Gefter M.，1970和1971年）在细胞内DNA聚合酶不是真正的复制酶，而是修复酶。作用：以dNTP为底物，从53合成DNA，引物为小缺口的双链DNA，一分子酶每分钟催化约2400个核苷酸聚合。具有35外切酶活性，不具备53外切酶活力。聚合酶也不是复制酶，而是修复酶。DNA聚合酶由多个亚基组成，在E.Coli内真正起复制作用。它催化的DNA合成速度达到了体内DNA的合成速度。3） DNA聚合酶和（1999年）当DNA严重受损时，其它DNA聚合酶会停止复制，而DNA聚合酶和可以通过高突变率跳过障碍，继续复制。主要功能：修复错误倾向，它们可使修复准确性降低，而导致高突变率。 3.DNA连接酶DNA连接酶催化双链DNA切口处的5-磷酸基团和3-OH共价连接生成磷酸二酯键。细菌的连接酶以NAD+为能源，动物细胞则以ATP作能源。（大肠杆菌连接酶不能将两条独立的DNA链连接起来，只能连接已形成双螺旋结构的断开的两条链。）（四）、DNA的半不连续复制 1、DNA的半不连续复制DNA复制时，沿复制叉移动方向，一条模板链是35方向，称前导链，另一条是53走向，称滞后链。DNA在前导链上能以53方向连续合成, 在滞后链上合成不连续，且相反于复制叉前进方向。DNA在滞后链上首先以53方向形成许多不连续的小片段，最后由DNA连接酶连接成完整的DNA链。3、DNA合成由RNA引物引发RNA引物能够引发DNA新链的合成。RNA引物的合成简单得多，RNA酶催化的反应只需要模板，不需要引物。冈崎片段的合成引物：RNA；引物合成方向：53，与DNA链互补；催化引物合成的酶：引物合成酶；引物长度：几个至十几个核苷酸。滞后链的合成在DNA聚合酶作用下，从引物的3-OH开始合成DNA片段，由DNA聚合酶填补缺口，消除引物，最后由连接酶将各片段连接起来，完成滞后链的合成。（五）、DNA复制的拓扑性质核酸的拓扑结构指核酸分子结构的空间关系，两条互相缠绕的双螺旋DNA分子表现出许多拓扑关系。+=，其中：双链闭环DNA的互绕数拓扑连环数，为整数；：DNA的螺旋数或扭转数；B型DNA的bp数/10.4；：超螺旋数或缠绕数。和的正负值分别表示右手螺旋和左手螺旋。DNA复制时首先要解开双链，解链产生的扭曲张力不可能通过DNA分子的高速旋转来释放，而是通过拓扑异构酶来完成。拓扑异构体（topological isomers）：连环数不同，其它性质相同的DNA分子拓扑异构酶（topoisomerase）：能引起拓扑异构反应的酶。 拓扑异构酶：能使超螺旋DNA的一条链断裂并将其重新连接起来，无需供能。主要集中于细胞的活性转录区，与转录有关。作用：消除超螺旋状态，将共价闭环的超螺旋DNA变为松驰态，不改变DNA的化学组成和结构。拓扑异构酶：能使DNA两条链同时断裂和再连接，当引入超螺旋时需由ATP供能。（六）、DNA的复制过程DNA的复制分为起始、延伸和终止三个阶段。DNA复制过程十分复杂，涉及几十种酶和蛋白质的协同作用，它们分布在DNA合成的生长点（growth point），即复制叉上，构成的复合物称复制体（replisome）。1.复制的起始引物合成酶合成RNA引物，DNA复制开始， 复制一旦发动，通常会进行到底。2.复制的延伸前导链和滞后链的合成同时进行。3.复制的终止当两个复制叉在终止区相遇，复制体解体，两条亲代链解开，但此时尚有50100个碱基对未被复制，它们将通过修复方式填补空缺。七）、真核生物DNA的复制1、真核生物DNA复制的特点真核生物DNA的基因组比原核生物大，复制时DNA与组蛋白构成核小体，复制过程更复杂。1）复制速度比原核生物慢；2）有多个复制起点，可以分段复制3）复制完成前，起点不再开始新的复制（原核生物则可连续发动复制）4）采用更多的复制起点加速复制2、真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶有、和。DNA聚合酶的共同性质：需要模板，需要引物，以dNTP为底物，依靠Mg2+激活，链的延伸方向为53；主要区别：真核生物DNA聚合酶一般无外切酶活力。DNA聚合酶：具有引物合成酶的活性，与DNA聚合酶一起合成细胞核染色体；DNA聚合酶：是修复酶；DNA聚合酶：是线粒体DNA的合成酶；DNA聚合酶：是一种具有校对功能的修复酶，相当于细菌DNA聚合酶；DNA聚合酶：有35外切酶活力，有持续合成能力，有校对功能。是真核生物DNA复制的主要聚合酶。真核生物DNA复制中前导链和滞后链的合成分别由两个DNA聚合酶完成。3真核生物DNA的端粒结构真核生物染色体DNA的两个末端都有一个特殊结构，叫作端粒(telomer)，该结构由许多成串的短的重复序列组成，其中一条链富含G，互补链富含C（人的端粒为TTAGGG）。功能：稳定染色体末端结构，防止末端连接，并且对线性分子可以补偿滞后链5-末端RNA引物消除后的空隙。端粒酶：逆转录酶，分子内含一条RNA链，约150个碱基。DNA的端粒结构由端粒酶催化合成，合成端粒结构时，端粒酶以自身携带的RNA 5端识别DNA 3末端。端粒酶的作用：可以维持DNA端粒结构的长度，若端粒酶活性降低，最终将导致细胞凋亡。端粒对细胞寿命有重要影响，主要的肿瘤细胞都存在端粒酶活性。4、细胞周期真核生物的细胞周期分四个时期G1、S、G2、M。G1期：DNA复制准备期。细胞合成DNA复制时所要求的蛋白质和RNA，包括底物、DNA复制酶系、辅助因子和起始因子等。S期：DNA合成期（约7hr），细胞DNA开始复制，顺序为先常染色质，后异染色质。G2期：细胞分裂准备期（约为4小时），有丝分裂前的准备期。M期：有丝分裂期（约1hr），细胞进行实质性的细胞分裂。 S期、G2期和M期的长短比较恒定，只有G1期变动较大，一般12hr以上。 二、DNA的损伤及修复 1、错配修复DNA复制时，尽管聚合酶有双重校对功能，仍然不能绝对避免随机的碱基错配，而一旦错配发生，就有可能导致基因突变。错配修复系统就是针对这种疏漏或其它原因导致的错配而进行的校正系统。主要有两步：1）模板链的识别 关键：识别真正的模板链，修复系统的识别能力来自于DNA的自我标记；2）修复过程2、直接修复紫外线照射可以使同一条DNA链相邻的两个嘧啶碱基发生类似于2+2的反应形成环丁烷结构，从而影响DNA的复制和转录。光复活酶修复：可见光(=400 nm)激活光复活酶，激活的光复活酶高度专一地分解由于紫外线照射形成的嘧啶二聚体；哺乳类动物直接切除含嘧啶二聚体的一段序列，然后修复合成。3、切除修复切除修复是指在一系列酶的作用下，DNA分子的损伤部位被识别和切除，再以完整的链为模板修复合成出删除部分，最后恢复DNA正常结构的过程。参与切除修复的酶主要有：核酸内切酶、外切酶、聚合酶、连接酶。 1) 碱基切除修复 针对单个碱基缺陷进行的修复 2） 核苷酸切除修复当DNA双螺旋结构变形较大时，生物体采用核苷酸切除修复方式进行修复。核苷酸切除修复是由核酸内切酶在损伤部位两侧同时切开，依靠解旋酶脱去切除部分，再由聚合酶和连接酶修复。4、重组修复切除修复是复制前修复，修复发生在DNA复制之前，重组修复发生在复制开始后。若DNA受损部位尚未被修复，而DNA复制已开始，此时细胞内的重组修复系统开始工作，它可以使未修复的损伤部位先复制再修复。结构损伤的DNA复制时会跳过损伤部位，子代链在相应处留下缺口，并且无法以母链作模板，于是它将同源DNA的母链移至自身缺口处，同源DNA母链的缺口再通过聚合酶和连接酶修复，该过程为重组修复，也叫作复制后修复。5、应急反应（SOS）和易错修复许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应(SOS response)。SOS反应包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、抑制细胞分裂以及溶原性细菌释放噬菌体等等。避免差错的修复：错配修复、直接修复、切除修复和重组修复并不引入错配的碱基。易产生差错的修复：诱导产生没有校对功能的DNA聚合酶和，它们允许损伤部位的碱基错配并继续复制，如此可以大大提高细胞的存活能力。三、RNA指导下的合成逆转录 逆转录指以RNA为模板合成DNA的过程，催化逆转录反应的酶称RNA指导的DNA聚合酶（RNA-directed DNA polymerase），也称逆转录酶（reverse transcriptase）。1、逆转录酶的性质逆转录酶具有与DNA聚合酶相似的性质，它催化的DNA合成要求模板、引物、dNTP、Mg2+或Mn2+，链延长方向为53。逆转录酶是一种多功能酶，兼有三种酶活力：1）RNA指导的DNA聚合酶活力利用RNA作模板合成互补DNA；2）DNA指导的DNA聚合酶活力以新合成的DNA为模板合成互补DNA；3）RNase H的活力水解RNA-DNA分子中的RNA，沿35和53方向起外切酶的作用。2、致癌病毒RNA的逆转录过程致癌RNA病毒都称为逆转录病毒。逆转录病毒的基因通常由两条相同的(+)RNA链所组成，当逆转录病毒侵染宿主细胞后，病毒RNA进入细胞，开始逆转录过程。病毒(+)RNA(模板) (-)DNA (+)DNAssDNA整合进入宿主染色体DNA转录双链DNA形成后，即整合到宿主基因组中，进入宿主的生活周期。整合是逆转录病毒生活周期中的必要步骤，因为逆转录病毒DNA只有在整合进宿主细胞的DNA后才能转录。DNA指导下RNA的合成 DNA指导下的RNA的生物合成称为转录，转录是以DNA为模板通过RNA聚合酶催化合成出与DNA链碱基互补的RNA链的过程。（一）、RNA的转录过程 RNA的转录从DNA 链上一个特定起点开始，在终点处结束，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因，也可以包含多个基因。1编码链和