拟南芥转化.docx

1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于5 ml含100 g/ml利福平(Rifampicin)，50 g/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 g/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 l接种于 50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4离心10分钟，加入10 ml预冷的 20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4离心10分钟；加入2 ml预冷的 20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 l，液氮中速冻后，置-80保存备用。2.质粒转化农杆菌 GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化 (冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80冰箱中取出 GV3101 感受 态细胞 (100 l)，置于冰上解冻；2) 加入 5 l 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴 5 min；3) 液氮冷冻 8 min；4) 37水浴热激 5 min；5) 加入 900 l LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于 28，160 r/min 振荡培养35 h 复苏；6) 复苏结束后于 4000 r/min 室温离心 5 min；7) 吸去 800 L 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于 LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28倒置培养 2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经 LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落 (液) PCR验证，以确认是否成功转化。经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。转化时将拟南芥的花序倒扣在盛有菌悬液的容器中，浸泡10-30秒，转化完毕后，将小花盆侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，12-24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，按照正常的方法培育植株至结实，收获成熟种子 将已经转化的Tl代成熟种子收取后，37烘干后准备阳性植株的筛选。由于表达载体带有除草剂抗性标记基因，所以用Basta(l:1(XX)进行阳性植株的筛选。将Tl代种子在消毒之后均匀撒播在培养土的表面，罩上盖子，当种子出苗后3天，打开盖子，在幼苗生长到2礴片真叶后，喷洒Basta筛选阳性植株。)3拟南芥培养和转化3.1 拟南芥培养首先是拟南芥种子消毒，将待播拟南芥种子 (每管 100 L) 分装于 1.5 mLEppendorf 离心管中，每管加入 1 mL 70%乙醇，振荡器上充分混匀，放置 2 min，微型离心机上离心后，用 1 mL 枪头吸去乙醇，然后加入 1 mL 10%NaClO，振荡器上充分混匀，放置 15 min，期间每隔 5 min 可以轻微振荡一次，可以提高消毒效果，离心后，弃上清，用无菌水冲洗 5-6 次，并于超净台上吹干，即可播种。将种子撒播于 MS 固体培养基上，也可用 45 MS 固体培养基播种，方法是将种子和 MS 固体培养基充分混匀，倾倒于预先铺一薄层 MS 固体培养基平皿中，轻微晃动平皿，使种子均匀平铺在培养皿中。平皿用封口膜封好后在 4暗处理 3 d。置于拟南芥培养室培养 ( 培养条件：湿度 60%；温度 22；光周期 16 h 光/8 h 暗；光照强度80220 mol m-2 sec-1) 培养一周左右，然后将其移栽至栽培介质 (草炭土：蛭石：珍珠岩按 5：4：1 的比例掺匀)，第一次移栽要用 0.1%“花无缺”复合肥溶液浇灌渗透。3.2 拟南芥转化拟南芥转化采用 Clough 等发明的活体蘸花法 (Floral-dip)。具体步骤如下：1) 转化前菌体准备：挑取平板上生长良好的阳性菌落，接种于 20 mL LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基中，28，250 r/min 振荡培养过夜。吸取 2 mL 培养液，加入 50 mL LB/ (Gen + Kan+ Rif) 液体培养基，28，250 r/min 振荡培养至浓度为 OD600 = 0.5-0.8，然后 4500 r/min 离心收集菌体，用 20 ml 拟南芥转化 Buffer (2.2 g/L MS 粉 + 5g/L 蔗糖 + 6-BA (1 mg/mL) +0.04%SILWET-77 (v/v)，pH 5.8；蒸馏水配制，现配现用。) 悬浮。2) 转化：选取生长一个月左右、生长状况良好的植株，在转化前一周掐除顶端花序，使待转化植株产生更多的花蕾，在转化前一天浇足水。将拟南芥花序浸入事先准备好的转化 Buffer 中，并轻微晃动，约 35 sec 取出，轻轻弹去多余的液体，用保鲜膜将整棵植株密封，暗培养 16-24 h 后，揭去保鲜膜，给予正常光照和水分，直至种子成熟，收获。3.3转基因植株抗生素筛选将所收获种子消毒 (条件同上) 后，播于 M