（植物学专业论文）拟南芥花粉管振荡生长观察及其调控机制的初步研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意 研究生签名 张复王时间 如午年 月 f 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复制手 段保存 汇编学位论文 同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学 位论 之的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议1 研究生签名 璇曼正时间 如牛年彳月hf i 导师签名 时间 加年年e 摘要 极性生长的花粉管表现出振荡式生长的特性 但其机理还不清楚 本论文工作选 用拟南芥花粉管为实验材料研究花粉管振荡生长的调控机制 由于拟南芥花粉管比较 细小 生长速率较慢 本实验采用了自行设计的一种观察装置 可以方便 精确地观 察拟南芥花粉管的生长行为 观察发现 体外生长的拟南芥花粉管存在两种振荡生长 方 式 一种与p a r t o n 2 0 0 3 报道的周期性振荡生长行为相似 每个振荡的周期与振 幅 鞋本相同 平均周期为2 4 1 秒 此外 本实验还首次观察到一种新的振荡生长方 式 命名为 双重振荡 在花粉管生长速率呈现周期性变化的同时 生长振荡的振 幅也表现出 小一大一小 的规律性变化 般每5 6 个生长振荡形成一组 称之为 组合振荡 组合振荡的平均周期为1 1 3 4 秒 这种振荡生长方式在其它种类花粉 管中没有报道 作为调控花粉管极性生长的重要因子 c 2 和微丝在调控花粉管极性生长过程中 可能存在相互作用 伴随花粉管的振荡生长 花粉管顶端的c a 2 浓度梯度和微丝的聚 合一解聚状态会发生周期性变化 本研究以拟南芬花粉管为材料 通过转基因技术 将分别标记c a 2 和微丝的两种荧光蛋白c a m e l e o n 与g f p m t a t i n 在花粉管中同时表 达 实现活体花粉管中c a 2 与微丝的同时标记 该系统的完成为研究花粉管振荡生长 过程中c a 2 与微丝的相互关系做了材料上的准备 关键词 拟南芥 花粉管 振荡生长 c a 2 微丝骨架 a b s t r a c t p o l l e nt u b eg r o w t ho s c i l l a t e s i nr a t e t h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s m st h a tc o n t r o l o s c i l l a t o r yg r o w t hh a v eb e e n1 l r l k r l o w n t h e r e s e a r c hf o rt h i st h e s i su s e dp o l l e nt u b e so f a r a b i d o p s i st h a l i a n aa st h em o d e l m a t e r i a lt os t u d yt h em e c h a n i s m s b e c a u s eo f i t ss l o w g r o w t hr a t ea n ds m a l lv o l u m e as p e c i a ld e v i c ew a sd e s i g n e dt oo b s e r v et h ep o l l e nt u b e g r o w t ha n dt h ed y n a m i c so fo r g a n e l l e s m o r ee a s i l ya n da c c u r a t e l y t w op a t t e r n so f a r a b i d o p s i sp o l l e nt u b eo s c i l l a t o r yg r o w t hw e r ed e t e c t e db yu s i n gt h i sd e v i c e o n ei s s i m i l a rt ot h a to fp a t t o n s 2 0 0 3 r e p o r tw i t ht h eg r o w t hp r o c e s so s c i l l a t e i u ga tt h es a r e e f r e q u e n c ya n da m p l i t u d e t h ea v e r a g ep e r i o do f t h i sk i n do s c i l l a t o r yg r o w t hi s2 4 1s t h eo t h e ri san e w p a r e m o t h e r t h a nt h ep e r i o d i co s c i l l a t i o ni np o l l e nt u b eg r o w t hr a t e t h ea m p l i t u d eo fe a c ho s c i l l a t i o na l s oc h a n g e si na i lo s c i l l a t o r yb e h a v i o u r t h e a m p l i t u d e o ft h eg r o w t hr a t ei n c r e a s e sf r o ms m a l lt o l a r g e a n dt h e nr e d u c e s t o s m a l l e v e r y c o m p l e xi sc o m p o s e do f5 6g r o w t ho s c i l l a t i o n s w en a r a ei t c o m p o s i t eo s c i l l a t i o n t h a v e r a g ep e r i o do ft h e c o m p o s i t eo s c i l l a t i o n i s 11 3 4s t h i si st h ef i r s tt i m et o r e p o r t t h i sp a r e r n o f p o l l e nt u b eo s c i l l a t o r yg r o w t h i np l a n t s c y t o s o l i cf r e ec a z a n da c t i nm i c r o f i l a m e n t sp l a yc r u c i a lr o l e si nt h er e g u l a t i o no f p o l l e nt u b eg r o w t h a n d t h e ym a y i n t e r a c tw i t he a c ho t h e r i th a v eb e e n p r o v e d t h a tt h et i p c a z i a n dt h ea m o u n to ft i pf a c f i no s c i l l a t e sp e r i o d i c a l l ya c c o m p a n yt h eo s c i l l a t o r y g r o w t ho fp o l l e nt u b e s i nt h i ss t u d y i no r d e rt oe x a m i n et h ed y n a m i c so ft i p c a 2 i t o s 譬t h e rw i t ht h ed y n a m i c so ft i p l o c a l i z e d f a c f i ni nv i v o ak i n do fd o u b l el a b e l e d m a t e r i a lw a sc o n s t r u c t e d t h ec 一 a n da e t i nm i c r o f i l a m e m s o f a r a b i d o p s i sp o l l e nt u b e s w e r el a b e l e db yc a m e l e o na n dg f p m t a l i nr e s p e c t i v e l y w i t ht h e s e t r a n s g e n i cm a t e r i a l s t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt i p c a 2 ia n dt i p l o c a l i z e df a c t i ni np o l l e nt u b e sd u r i n gt h e o s c i l l a t o r yg r o w t h c a nb ew e l ls t u d i e d k e yw o r d s a r a b i d o p s i s p o l l e nt u b e o s c i l l a t o r yg r o w t h c a 2 a c t i nm i c r o f i l a m e n t s 2 英文缩写英文名称 b a p t a c d c c d d i d s l a t b m e s f a c t i n g e c t i n t r i s 英文缩写表 1 2 一b i s 2 一a m i n o p h e n o x y e t h a n e n n n n t e t r a a c e t i ca c i d c y t o c h a l a s i nd c h a r g e dc o u p l e dd e v i c e 4 4 d i i s o t h i o c y a n a t o s t i l b e n e 一2 2 一d i s u l f o n i ca c i d l a t r u n c u l i nb 2 r n m o r p h o l i n o e t h a n e s u l f o n i aa c i d f i l a m e n t o u sa c t i n g l o b a la c t i n t r i s e t h 3 r i t h i o m e t h a n e 3 一 中圃农业大学碳l 学位论文 文献综述 第一部分文献综述 开花植物的雄配子体存在 花粉中 花粉落在柱头上 萌发出花粉管 花粉管通过顶端生长 的 了式 在花柱和子房内某些化学和生物因子的引导下 穿过花柱 伸入子房 进入胚珠 在这 里花粉管顶端破裂释放精核 实现受精 花粉管的极性生长是开花植物实现受精的关键环节 花 粉管也成为研究细胞信号转导 细胞生长调控和细胞极性生长的模式系统 1 花粉管极性生长的调控机制 体外生长的花粉管也表现出极性生长的特性 研究发现c a 微丝骨架 小g 蛋白和h k c 1 都参与了花粉管极性生长的调控 并起着重要的作用 1 1 c a 在花粉萌发和花粉管极性生长中的作用 c 一是花粉萌发和花粉管生长所必须的因子 b r e w b a k e r 和k w a c k 1 9 6 3 k w a c k 1 9 6 7 j a f f e 等 1 9 7 5 p i c t o n 和s t e e r 1 9 8 3 s t e e r 和s t e e r 1 9 8 9 在花粉萌发的过程中 即将长出花粉 管的萌发孔区域会有c 一 的积累 p o l i t o 1 9 8 3 在正常生长的花粉管顶端 则存在一个由顶端 到远端 由高到低的胞内c a 2 浓度梯度 花粉管顶端c a 浓度处于2 m 至1 0p m 的范围 在十 儿个微米的距离内迅速下降到约2 0 0n m 的水平 用c a 2 特异性荧光探针 r a t h o r e 等 1 9 9 1 m i l l e r 等 1 9 9 2 和水母发光蛋白荧光测定技术 m e s s e r l i 和r o b i n s o n 1 9 9 7 m e s s e d i 等 2 0 0 0 均观察到这个现象 花粉管顶端c 矿 梯度与花粉管生长密切相关 是花粉管正常生长所必须的条件 向花粉管内 注射c a 特异性螯合剂 b a p 惦类缓冲液会使顶端c 矿梯度消失 导致花粉管顶端生长受抑制 m i l l e r 等 1 9 9 2 p e r s o n 等 1 9 9 6 对于生长被抑制的花粉管 顶端c a 2 梯度的再形成是其恢 复 仨长的先决条中 m i l l e r 等 1 9 9 6 r a l h o r e 等 1 9 9 1 p i e r s o n 等 1 9 9 4 l j 等 1 9 9 6 m a l h 6 平 t r e w a v a s 1 9 9 6 此外 顶端c 矿梯度还控制着花粉管生长的方向 利用离子渗透法 施加 电场或笼化c a 2 c a g e d c 矿 光解释放技术 人为改变花粉管顶端c a 2 梯度的对称性可导致花 粉符生跃方向的政变 m a l h 6 等 1 9 9 4 t 9 9 6 花粉管顶端胞质c 扩的局域性升高可诱导花粉 管在c a 升高区域形成新的生哎轴 并转向此方向继续生欧 m a l h 6 等 1 9 9 6 花粉管顶端c a 2 t 梯度的形成和维持所需c a 可能有两个来源 胞外c a 2 内流和胞内c a 2 侔叶1c a 2 的动员 胞内c a 2 十席中的c a f 要由i p 3 信号系统动员释放 已经证明 花粉管中 ri p 信 j 系统笑键酶p l c p h o s p h o t i d yl i n o s i l o lp h o s p h o l i p a s ec 活性存在 h e l s p e r 等 1 9 8 7 f r a n k l i n t o n g 等 1 9 9 6 而且f r a n k l i n t o n g 等发现 p l c i p 3 信号系统通过引起胞山c a j g q c 一 的释放而导致花耢管胞质c a 水平明显上升 这种c a 2 升高在细胞核附近引发一种慢速传向 花粉管顶端的c 一 波 最终影响花粉管生长 这说明胞内c a 2 库参与顶端c a 2 十梯度形成进而影响 花粉管生眨 而更多的研究则表明 咆外c a 2 十的内流可能在花粉管顶端c 矿梯度的形成和维持中 4 中幽农业人学坝i 学位论义 c献综述 g s e e g 目s 目 n p 主 要地位 花粉管止常生长需要胞外存在一定浓度的c d b r e w b a k e r 和k w a c k 1 9 6 3 k w a c k 1 9 6 7 j a f i e 等 1 9 7 5 p i c t o n 和s t e e r 1 9 8 3 s t e e r 和s t e e r 1 9 8 9 胞外加入一定培的c 一 通 道抑制剂会导致花粉管顶端c a 2 梯度消失 随后花粉管生长也被显著抑制 p i e r s o n 等 1 9 9 6 w e i s e n s e c l 雨 w e n i s c h 1 9 8 0 而且 在花粉管生长过程中可以测到明显的集中在花粉管顶端区 域的胞外c a 2 离子内流 胞外施加c a 通道抑制荆可以使该电流消失 p i e r s o n 等 1 9 9 6 m a l h 6 等 1 9 9 5 利 l jm n 漂白c d 特异荧光探针技术所作的工作间接证明花粉管顶端可能存在质膜 c a 通道 我们实验室通过膜片钳技术 鉴定到超极化激活的拟南芥 a r a b i d o p s 如t h a l i a n a 花粉 原生质体质膜内向c a l 电流 为花粉管顶端质膜存铂 c a 通道提供了更为直接的证据 未发表数 据 花粉管顶端c f 梯度对花粉管极性生长有重要调控作用 但其作用机制目前还不清楚 植物 细胞内膜囊泡分泌过程对胞内c f 具有一定依赖性 s u t t e r 等 2 0 0 0 因而推测顶端c 矿梯度可 能通过调控花粉管顶端小囊泡的运输和分泌过程参与对花粉管顶端极性生长的调节 但深入的研 究仍有待进行 作为植物细胞信号转导过程中重要的第二信使 c 矿调控花粉管极性生长的过程 必将涉及其它参与该过程的调节的冈子 通过与其它因子的相互作用来共同实现对花粉管极性生 妊向调节 植物中位于c 矿信号下游响应c a 2 信号的元件 如c d p k 很有可能参与该过程 1 2 微丝骨架在花粉萌发与花粉管极性生长中的作用 早期的研究已经证明 微丝骨架在花粉萌发和花粉管生长过程中起着重要的调控作用 见综 述v i d a l i 和h e p l e r 2 0 0 0 s t a i g e r 2 0 0 0 在花粉的成熟过程中伴随有细胞内微丝骨架结构的变 化 成熟后的花粉在萌发孔处质膜内侧存在一个由微丝组成的片状 p a t c h 结构 z o n i a 2 0 0 0 决定了花粉萌发时花粉管伸出的位置 水合前 花粉中的肌动蛋白 a c t i n 多以纺锤型和针型结 构存在 这是一种肌动蛋白的存储形式 水合后 这两种形式的肌动蛋白迅速重排形成微丝网络 y o k o t a 和s h i m m e n 2 0 0 0 在即将萌发的花粉细胞中 较细的微丝网络进一步重排形成微丝 束 沿指向葫发孔的方向排列 并参与花耢管伸出的过程 v i d a l i 和h e p l e r 2 0 0 0 花粉管中的微丝结构可以分成两种类型 一种楚狂花粉管中人量存在的 位于花粉管质膜 1 方 沿花粉管纵轴方向平行排列的微丝束 这是一种较租地微丝柬 它分布在花粉管主干部分 直延伸到花粉管的近项端 s u b a p i c a l 区域 这种微丝结年 可以利 l f 各种标记微丝的方法清晰 地昆示 m i l l e r 簿 1 9 9 6 p e r d u e 等 1 9 8 6 p i e r s o n 等 1 9 8 6 花粉管生k 过程伴有旺盛的胞 质环流 在靠近质膜的区域胞质环流的方向沿妖轴方向指向花粉管顶端 在咂顶端区域从细胞中 部折嗣 形成独特的 倒喷泉 形式 般认为花粉管中胞质环流的驱动力来 j 微丝 肌球蛋向系 统 近质膜纵向排列的微丝求是肌球篮r 1 运行的轨道 从阿合花粉中提取出一种1 7 0k d 的肌球 篮1 1 该肌球蛋白具有f a c t i n 激活的内 a t p a s eh i l t y o k o t a 和s h i m m e n 1 9 9 4 可以定位 枉自合平 烟草花粉管的细胞器膜表面 y o k o t a 等 1 9 9 5 而且在体外能够以5 8g m s e c 的平均 速度在f a c t i n 上滑行 这与卣台花粉管胞质环流的速度一致 y o k o t a 和s h i m m e n 2 0 0 0 而沿 轴同排列的微缝求则保自f 小囊泡被运送到花粉管顺端 为花粉管项端生长提供成膜 成艟物质 从而参与花粉管的极性生k t a y l o r 年1 1h e p l e r 1 9 9 7 f r a n k l i n t o n g 1 9 9 9 y o k o t a 和s h i m m e n 中目农业人学坝士学位论文文献练述 暑鼍舅曼曼曼 鼍皇墨 皇量兰曼尝曼曼 晕曼舅舅e 曼曼 苎曼曼舞曼曼曼曼舅曼量鼍鼍 舅曼量置曼曼曼曼量 i 皇罡曼量 皇量邕罡 皇1 2 0 d o 最近的研究表明 不同于这种粗的微丝柬 在花粉管顶端和亚顶端存在一种精细的微丝结构 它对花粉管极性生k 有重要的调控作 j 关于花粉管顶端的透明区 c l e a rz o n e 中是否存在微丝 骨架曾经存在争议 早期 利用化学固定剂和鬼笔环肽 p h a l l o i d i o 荧光标记技术进行的研究表 明花粉管顶端存在密集豹微丝网络结构 d e r k s e n 等 1 9 9 5 而采用快速冷冻 冷冻置换并结合 电子和光学显微镜技术只在花粉管顶端观察到一些短小的随机分布的细微丝束 l a n c e l l e 等 1 9 8 7 t i w a r i 和p o l i t o 1 9 8 8 d o r i s 和s t e e r 1 9 9 6 但通过显微注射的方法 用荧光标记的鬼 笔环肽对自台花粉管内微丝结构进行活体标记 却没有在花粉管顶端看到微丝结构的存在 m i l l e r 等 1 9 9 6 用转基因的方法将联有g f p g r e e n f l u o r e s c e n c ep r o t e i n 基因的m t a l i n m o u s et a l i n 转入烟草 n i c o t i a n at a b a c u m 也没有观察至 花粉管顶端的微丝结构 k o s t 等 1 9 9 8 这些结 果导致人们认为花粉管顶端韵透明区内可能不存在束状锻丝结构 k o s l 等 1 9 9 8 v i d a l i 和f i e p l e r 2 0 0 0 z h e n g 和y a n g 2 0 0 0 但是利用改进的细胞固定方法 s t a i g e r 等 1 9 9 4 和g f p m t a l i n 表达技术 k o s t 等 1 9 9 8 f u 等 2 0 0 1 得到的结果显示在花粉管近顶端存在一个环状微丝结 构 利用化学固定的方法在玉米和虞美人花粉管的近顶端区域也观察到类似的领状结构 c o l l a r s t r u c t u r e g i b b o n 等 1 9 9 9 g e i t m a n n 等 2 0 0 0 用低浓度的c d 或l a tb 处理花粉管 会使 近顶端区域的环状微丝结构受到明显破坏 花粉管极性生长也受到明显抑制 但是这种处理不会 对花粉管主干部分的粗微丝束和胞质环流造成明显影响 g i b b o n 等 1 9 9 9 v i d a l i 等 2 0 0 1 说明 近顶端环状微丝结构与花粉管主干中的粗微丝束不同 可能是由精细的微丝柬构成 在调 控花粉管极性生长的过程中发挥不同的作用 利用提高了荧光强度的g f p 与m t a l i n 构建的融合 蛋白 f u 等 2 0 0 1 清楚地证明了在正常生长的烟草花粉管顶端存在细微丝束结构 而且处于高 度动态变化的状态 微丝结构的高度动态变化表明肌动蛋白丝 f a c f i n 处于快速的聚合一解聚 变化之中 花粉管近顶端区域的环状微丝结构也会随着顶端徽丝的动态变化而发生相应变化 同 时有证据表明 百合花粉管顶端有大量的单体肌动虽白 g l o b a la c t i n g a c t i n 存在 而且g a c t i n 浓度璺现自顶端到远端由高到低的梯度分布 l i 等 2 0 0 1 花粉管顶端存在的大量g a c t i n 为顶 端微丝结构快逋的动态变化提供了物质基础 高度动态变化的顶端精细微丝骨架结构的发现 对研究花粉管极性生长有重要意义 花粉管 中微丝骨架的作用不再只是传统意义上的胞质环流的动力系统 它还可能作为重要的信号分子或 信号转换器参与花粉管极性生长的调控 微丝骨架与其它信号分子问的相互作用是现在研究花粉 管极性生长调控机制的重要课题 1 3 g 蛋白在花粉萌发和花粉管极性生长中的作用 g 蛋向是g t p 结台蛋向的统称 具有g t p 酶 g t p a s e 活性 其中 异三聚体g 蛋白和小 g 蛋白是参与细胞信号转导且研究较多的两类g 蛋门 孙火业等 1 9 9 8 异三聚体g 蛋白在动 物细胞信号转导过程中起重要作 h i 孙人业等 1 9 9 8 在植物中 异三聚体g 蛋白参与细胞分 化 胞外刺激信号传递 以及跨膜离子通道活性调节等过张 u l l a h 等 2 0 0 1 w a n g 等 2 0 0 1 也参与对花粉萌发利花粉管生长的调u m a 等 1 9 9 9 中圈农业人学硕上学位论文文献缘述 罡曼曼 查曼曼曼曼e 曼曼曼笪皇曼皇曼曼皇蔓曼曼 曼蔓曼曼曼舞舅量詈曼曼曼曼曼曼舅皇曼皇 暑量曼墨曼皇皇量 詈e 曼量e 曼 许多研究表明 相比较于异三聚体g 蛋自 小g 蛋白在植物细胞信号转导过程中发挥着更 为喧要的作h j 小g 蛋白是一个超人型蛋白家族 分为r a s r h o 和r a b y p t 3 三类 r a s 类 参与细胞生长 分化的调j 箝过程 r a b y p t 调节膜囊泡与蛋白质运输 而r h o 类则主要对微丝 骨架动态和功能进行调节 武维华和赵云云 1 9 9 6 真核细胞中r h o 类蛋白有9 0 多种 根据 其同源性可分为r h o p o p c d c 4 2 和r a c 四个亚家族 l i 和y a n g 2 0 0 0 其中r o p r h o g t p a s e s f r o mp l a n t s 是植物所特有的一个亚家族 w i n g e 等 1 9 9 7 l i 等 1 9 9 8 l i 和y a n g 2 0 0 0 现在 已知的r o p 成员有3 2 个 其中拟南芥有1 1 个 r o p 的表达有组织特异性 l i 等 1 9 9 8 拟南芥成熟花粉和花粉管中有r o p l a t r o p 3 a t 和r o p 5 a t 的表达 其中r o p l a t 在花粉中特异表 达并且在拟南芥花粉萌发和花粉管生长过程中起重要调控作用 l i 等 1 9 9 8 l i 等 1 9 9 9 对丁r o p l a t 持续激活型突变体 其花粉管生长会由极性生长变为向四周生长 而r o p l a t 的 过量表达导致r o p i a t 在质膜上异位积累 也会使花粉管生长失去极性 过量表达d o m i n a n t n e g a t i v er o p l a t 的突变体和表达有r o p l a t 反义r n a 的突变体 他们的花粉管生长在胞外c a 2 为 o 5m m 时会受到抑制 升高胞外c 一 浓度会缓解这种抑制 向豌豆花粉管中注射r o p l a t 的抗体 会使花粉管顶端c a 2 梯度消失 l i 等 1 9 9 9 r o p 5 a t 也表现类似功能 k o s t 等 1 9 9 9 同时 d o m i n a n tn e g a t i v er o p l a t 的过量表达还会抑制花粉萌发 而r o p l a t 的过量表达则促进花粉萌发 g u 等 2 0 0 3 通过酵母双杂的方法 w u 等 2 0 0 1 从拟南芥中找到一种r i c 蛋白 r o p l i n t e r a c t i n gp r o t e i n 命名为r i c i 生化鉴定表明r i c l 只与有活性的r o p l 结合 通过 g f p 标记的r i c l 蛋白 他们发现在正常生长的花粉管中有活性的r o p l 只定位在花粉管顶端的 细胞膜上 这与r o p l 其调控花粉管极性生长的功能相符 运用生物信息学的方法 通过同源序 列分析 w u 等又从拟南芥中找到l o 种r i c 其中 r i c 3 r i c 4 定位在花粉管顶端 与r o p l 共分布 过量表达r i c 3 r i c 4 均导致花粉管生长失去极性 推测r i c 3 r i c 4 是r o p l 调控花粉 管极性生长信号途径中下游的靶蛋白 f u 等 2 0 0 1 证明r o p l 可以调控花粉管顶端徽丝骨架的 动态变化 从而调控花粉管极性生长 但p o p 如何实现对微丝骨架动态变化的调节 r i c 3 r i c 4 的功能 以及r o p 信号与c 信号之间的关系还不清楚 1 4 i i c 和c l 在花粉萌发和花粉管生长中的作用 1 4 1 h 花粉萌发和花粉管生长需要合适的p h 胞质p h 变化显著影响花粉管生长 t u p y 和r i h o v a 1 9 8 4 徐秉芳等 1 9 9 6 对于胞内是否存在类似c a 梯度的p h 梯度一直存有争议 早期t u r i a n 1 9 8 i 报道了花粉管顶端酸性区的存在 后米f e u 6 1 9 9 5 发现超过一个p h 单位的p h 梯度 存f t 丁自子莲的花粉管顶端 蜓是 i j 后的 些研究刚认为花粉管顶端不存在p h 梯度 p a r t o n g 1 9 9 7 f r i c k e r 等 1 9 9 7 m e s s e r l i 承 r o b i n s o n 1 9 9 8 最近f e i j 6 等 1 9 9 9 研究发现 能 否检测到花粉管顶端胞质p h 梯度的芙键是装载p h 荧光探针的鼙是否合适 将荧光探针b c e c f 在花粉管内的浓度控制在0 6 i t m 可以检测到百合花粉管臼顶端到远端由低到高的p h 梯度和一 个处r 花粉管近顶端的碱性环带 利h j 振动电极测定发现 花粉管生长过程中顶端存在h i q 流 h 从花粉管顶端流入细胞 从碱性环带区域流出 p h 梯度 碱性环带利h 流动是花粉管生长所 中固农业人学硕l 学位论文 文献综述 必需的 f e i j 6 等 1 9 9 9 花粉管顶端细胞壁中高浓度的h 干能够降低果胶甲基酯酶p m e 的活性 使顶端细胞壁变松弛 调1 d 细胞肇的机械强度 h o l d a w a y c l a r k e 等 1 9 9 7 从而影响花粉管生长 胞内p h 还可以调 h 花粉和花粉管中内向k 通道的活性 f a n 和w u 1 9 9 9 f a n 等 2 0 0 1 此外 研究表明花粉 管中徽丝骨架结构变化受p h 变化的影响 a l l w o o d 等 2 0 0 2 1 4 2 k k 是花粉萌发和花粉管生长所必须的离子 b r e w b a k e r 和l k w a c k 1 9 6 3 w e i s e n s e e l 和j a f f e 1 9 7 6 f e i j 6 等 1 9 9 5 在正常生长的百台花粉管顶端可以测到大量的k 十内流 认为k 在维持胞 内膨乐 推动花粉管向前生长中起作用 m e s s e r l i 1 9 9 9 1 运用膜片钳技术在青菜 b r a s s i c a c 枷 p n s 括 拟南芥 f a n s t l w u 1 9 9 9 f a n 等 1 9 9 9 和百合 g r i e s s n e rm 和o b e r m e y e rg 2 0 0 3 花粉原生质体中鉴定到内向质膜k 通道 在三种细胞中内向k 电流均受到胞内p h 调控 m o u l i n e 等 2 0 0 2 证明拟南芥s h a k e rk 通道家族中的a k t 6 在拟南芥花粉和花粉管中特异表达 他们将 其命名为s p i k s h a k e r p o l l e n i n w a r d k c h a n n e l 将s p i i c 在哺乳动物c o s 细胞中异源表达 通 过电压钳的方法可以记录到明显的内向k 电流 通过t d n a 插入的方法破坏s p i k 的功能 拟南 芥花粉原生质体内向k t 电流会受到显著抑制 同时 突变体花粉管生长也受到显著抑制 说明k 通道在花粉管正常生长过程中起着重要的作用 奇怪的是 在以上的研究中均显示胞内c a 2 对花 粉原生质体内向k 电流没有影响 这与保卫细胞中观察到的结果明显不同 f a n 和w u 1 9 9 9 f a n 等 1 9 9 9 m o u l i n e 等 2 0 0 2 l u a n 等 1 9 9 3 1 4 2c 1 c r 在花粉萌发和花粉管生长中也起着重要作用 胞外施加c l 通道特异性抑制荆可以显著抑 制花粉萌发和花粉管生长 z o n i a 等 2 0 0 2 z o n i a 等 2 0 0 2 利用离子振动电极的方法在烟草 花粉管顶端测到大量c i 的外流 在近顶端区测到稳定的c l 内流 外向c l 通道特异性抑制剂d i d s 会导致花粉管顶端膨胀 同时抑制花粉管生长 花粉管顶端膨胀程度与d i d s 浓度相关 认为c l 在调节花粉管顶端膨压变化的过程中起重要作用 z o n i a 等 2 0 0 2 z o n i a 和f e i i 6 2 0 0 3 花粉管极性生长涉及复杂的信号转导过程和精确的生长调控 越来越多的证据表明 各种参 与花粉管极性生长调控的因子不是孤立地行使某项功能 他们之间或者存在上下游的关系 或者 有复袋而糖确的相互作用 研究各因子之间的关系有助于我们进一步了解花粉管极性生长机制 显微摄像技术的改进使人们记录动态变化过程的时问分辨率越米越高 利用这项技术 人们 发现极性生长的花粉管生长速度并不均一 丽是存在周期性变化 表现出振荡生长的特点 花粉 管振荡生长特性的发现被认为是该领域近1 0 年来一个重要的发现 r o b i n s o n 和m e s s e r 2 0 0 2 h o l d a w a y c l a r k e 和h e p l e r 2 0 0 3 a 它为研究参与极性生长调控的各因子之间的关系提供了重要 的时问坐标 r o b i n s o n 和m e s s e r l i 2 0 0 2 2 花粉管振荡生长 p i e r s o n 等 1 9 9 6 在观察自合花粉管体外生长时发现当花粉管生长到一定程度之后 7 0 0 8 中国农业火学硕士学位论文 文献综述 u m 花粉管的生长速率出现明显的周期性变化 变化范围在o 1 0 4i t m s e e 之间 生长振荡的平 均周期为2 3 秒 花粉管长度小于7 0 0p m 时生长速率的变化表现为无规则的波动 在烟草 l i 等 1 9 9 2 矮牵牛 g e i t m a n n 等 1 9 9 6 等花粉管中也检测到这种振荡生长的生长方式 现在 认为这是花粉管生长过程中普遍存在的一种特性 在花粉管振荡生长的过程中 参与调控花粉管极性生长的许多因子表现出周期性变化的特 性 作为花粉管极性生长的重要调控因子 顶端c 矿浓度在花粉管振荡生长的过程中呈现明显的 周期性变化 而且其振荡周期与花粉管生长振荡周期相同 说明顶端 c a 2 i 振荡与花粉管生长密 切相关 h o l d a w a y c l a r k e 等 1 9 9 7 m e s s e r l i 和r o b i n s o n 1 9 9 7 m e s s e r l i 等 2 0 0 0 利用c 扩 荧光探针比率成像技术和水母发光蛋白荧光测定技术已经反复证明了这个结果 通过改进的水母 发光蛋白测c 矿技术 使用更高的时间分辨率 m e s s e r l i 等 2 0 0 0 清楚地证明顶端l c 一 振荡 出现在生长振荡之后 但两者间隔时问很短 c a 2 i 振荡仅比生长振荡滞后4 秒 即1 0 5 度的相 位 振荡周期为3 8 7 秒 在百合花粉管中 花粉管顶端的贮 h 和c a 2 内流也表现出周期性变化的特性 振荡周期 与花粉管生长周期相同 m e s s e r l i 和r o b i n s o n 1 9 9 9 其中心内流和h 内流出现的时间基本一 致 在相位上分别滞后于生长振荡1 0 3 度和1 0 0 度 c r 内流滞后相对较多 为1 2 3 度 在以上 实验结果的基础上 m e s s e r l i 等 2 0 0 0 提出了膨压 t u r g o tp r e s s u r e 模型 来解释花粉管振荡 生长的机理 他们认为一介导的胞外k 离子内流的周期性变化会导致花粉管顶端膨压的周期性 变化 当膨压超过花粉管顶端细胞壁张力的阈值后 花粉管就会冲破细胞壁的阻碍 出现快速生 长 一方面 随着顶端细胞伸长 体积增加 膨压下降 一方面 由于新的细胞壁形成 花粉管 生长又被细胞壁的机械张力阻止 生长变缓 同时积累l 为下一次快速生长积蓄力量 对于 顶端 c a 2 i 振荡出现在生长振荡之后的现象 m e s s e d i 等认为这与张力的周期性变化有关 他们 推测顶端质膜张力周期性变化会引起质膜上可能的张力激活c a 2 通道活性的周期性交化 导致 c a 2 内流的周期性变化 周期性的c a 2 内流引发的胞内c a 2 库中周期性c a 2 释放 是顶端 c a 振荡的最终成因 但这并不能解释 c 一 振荡为什么恰好出现在生长振荡之后 此前 h o l d a w a y 等 1 9 9 7 曾经提出细胞壁张力模型 认为由于c a 2 和h 共同作用导致的花粉管顶端细胞壁机 械强度变化是花粉管振荡生长的成因 在他们的模型中 顶端 c a i 的最大值出现在花粉管最大 生长速率之前 显然与后来的实验结果不符 膨压模型能够解释部分实验现象 但对于顶端 c a i 振荡成因和出现时间的解释缺乏实验支持 而且由于现在的颡i 量手段无法对花粉管顶端可能的膨 压变化进行精确测定 使这个模挝缺乏最直接也是昂重要的证据 m e s s e r l i 等 2 0 0 3 通过改变 培养基中的c a 浓度 p h 渗透势和k 浓度对以上硒个模型进行验证 结果表明这两个模型都 不能很好地解释花粉管振荡生长的现象 z o n i a 管 2 0 0 2 利用离子振动电极的方法对烟草花粉管c i 一电流进行测定时发现一个有趣的 现豫 与存 顶端区测到稳定的c 1 内流不同 花粉管顶端存在的人避c 1 的外流表现山明显的周期 性变化特点 而且振荡的周期和相位 j 花粉苷生长振荡均相符 这预示着花粉管顶端c r 浓度的变 化可能是引发顶端膨压变化的原冈 这也支持了膨压变化模型 他们推测c a 2 十 和i n s 3 456 p 可 能参与了对该电流的调节 f u 等 2 0 0 1 已证明在花粉管顶端f a c t i n 与g a e t i n 之间聚台解聚处丁 高鹰动态变化之中 他们j i j 花粉管顶端g f p 荧光强度的强弱代表微丝骨架的聚合和解聚状态 发 现卜a c t i n 与g a c t i n 之间聚合解聚变化也阜现周期性变化的特点 与花粉管生长振荡周期相符 微 中瞰农业人学颁 l 学位论义 文献综述 i i 丝聚合状态程度最商的状态出现在花粉管快速生长之前 为了减小激光照射对花粉管生长的影响 以及荧光烨灭对观察的影响 f u 将两次幽像采集之间的时间间隔延长到1 5 秒 但这会对实验的时 间分辨率造成影响 无法提供微丝动态变化与生 振荡关系的更为详细的信息 此外花粉管中运 送成膜 成蹙物质的小囊泡在顶端的积累也璺现周期性变化 积累的最大龟出现在花粉管快速生 疑之前 p a n o n 等 2 0 0 1 但进一步的研究却发现 在经过b r e f e l d i n a 处理停j t 生长的百合花 粉管中小囊泡的积累还呈现周期性变化 只是振荡周期从正常生长时的3 0 秒变为5 7 秒 这种周期 性变化只与微丝骨架的动态变化有关 与花粉管生长和顶端 c 一 梯度存在与否无关 p a t t o n 等 2 0 0 3 它的生理意义还不清楚 尽管提出了细胞壁张力模型和膨压变化模型 但花粉管振荡生长的机制还不清楚 这两个模 型都是从机械张力的角度解释振荡生长现象 既没有引入微丝骨架这个重要因子 对c d 的讨论 仅限于对细胞壁机械强度的影响和如何解释c 矿振荡出现的时间 基本没有涉及振荡生长调控的 分子机制 可以说还很不完善 极性生长的花粉管同时存在振荡生长特性 这为我们研究花粉管极性生长过程中不同调控因 子间的上下游关系和相互作用提供了很好的时问坐标和检测系统 研究花粉管振荡生长机制将有 助于我们了解花粉管的极性生长过程 c a 2 与微丝骨架的相互作用 c e 与微丝骨架在调控花粉管极性生长的过程中都起着重要作用 越来越多的证据表明 在 花粉管中c a 2 和微丝骨架可能通过相互作用共同实现对花粉管极性生长的调节 不同于主干部分粗的微丝束 花粉管顶端存在精细的 动态变化的微丝结构 这可能与顶端 高浓度的c e 梯度密切相关 早期人们就发现升高的c a 2 浓度可以打断百合花粉管中微丝束 k o h n o 和s h i m m e n 1 9 8 7 近期的研究表明某些微丝结合蛋白可能参与了c a 对微丝骨架结构 的影响 绒毛蛋白 v i l l i n 是一类f a c t i n 结合蛋白 由一个凝溶胶蛋白 g e l s o l i n 同源结构域和 个称为头部 h e a d p i e c e 的f a e t i n 结合区域组成 在动物细胞中 绒毛蛋白能够象凝溶胶蛋白 那样以c a z 依赖性的方式切割f a c t i n 使f a e t i n 成核化和给f 8 c t i n 加帽 a n d r e 等 1 9 8 8 还能将 f a c t i n 以相同的极性方向 捆扎 成束 c o l u e c i o 和b r e t s e h e r 1 9 8 9 在拟南芥中己发现四个绒 毛蛋向的同功异构体 他们能够与植物和动物细胞的微丝束结合 k l a h r e 等 2 0 0 0 y o k o t a 等 1 9 9 8 在白合花粉管中鉴定到一种微丝结合蛋白1 3 5 a b p 随后的工作证明这是植物中的 种 绒毛蛋白 v i l l i n v i d a l i 等 1 9 9 9 它可以将f a e t i n 以相同的极性方向 捆扎 成 束 y o k o t a l l s h i m m e n 1 9 9 9 y o k o t a 和s h i m m e n 2 0 0 0 进一步证明1 3 5 一a b p 的这种活性能够被c e 和 c a l m o d u l i n 共同抑制 并推测这可能是花粉管顶端没有租微丝求的重要原冈 但他们没有检测到 i 3 5 一a b p 切刮微丝柬的活性 芙t c a 2