二氢嘧啶酶产生菌的筛选及发酵条件的研究.doc

二氢嘧啶酶产生菌的筛选及发酵条件的研究药物生物技术 1999年第2期第6卷 论文作者：李隽胡卓逸蔡萍单位：中国药科大学生化研 究室，南京 210009关键词：二氢嘧啶酶；恶臭假单胞菌；对羟基苯海因摘要通过筛选确定由恶臭假单胞(Pseudomonas putida)D菌产生的二氢嘧啶酶对5-对羟基苯海因的水解能力较强，该产酶菌发酵条件的研究表明酵母膏对产酶十分重要。甲硫乙基海因对二氢嘧啶酶具有强诱导作用。此产酶菌最适培养基组成为(%)：甘油1.0，酵母膏1.0，NaCl0.3，K2HPO43H2O0.2，甲硫乙基海因0.1，MgCl26H2O0.05，28，发酵18h，每ml发酵液酶活力为2.26U。 Screening of Strains Producing dihydropyrimidinaseand Fermentation Con ditionsli Jun, Hu Zhuoyi, Cai Ping(Division of Biochemistry,China Pharmaceutical University,Nangjing 210009)AbstractDihydropyrimidinase in intact cells of Pseudomonas putid a D has high specificity for5-(4-hydroxyphenyl)hydantoin.Optimum condition s for growth and dihydropyrimidinase formation of Pseudomonas putida D were defined:yeast extract is an essential factor for enzyme formation.5-Methylthi oethylhydantoin was found to be a strong effective inducer as well.Suitable med ium consists of yeast extract 1.0%,glycerol 1.0%,K2HPO43H2O0.2%,NaCl ，0.3%,5-methlythioethylhydantoin. 0.1% and MgCl26H2O0.05%.When the organism was growth at 28 for 18h,about 2.26units/ml of dihydropyrimidinase was otained.Key WordsDihydropyrimidinase, Pseudomonas putida,5-(4-hydroxyp henyl)hydantoinD-氨基酸是制备-内酰胺类抗生素如羟氨苄青霉素，头孢菌素的重要中间介质。同时，它也是合成多肽类激素，多种农药的中间体1。最常见制备的方法有3种，其中最经济的方法应属生物酶法即二氢嘧啶酶水解海因类化合物制备法2。Eadie等人发现在动植物组织中存在有降解海因类化合物的酶，此种酶能将海因水解成海因酸3，4，以后，Wallach和Grisolic又从牛肝中制得此种酶，因能催化二氢尿嘧啶生成N-氨基甲酰-丙氨酸，所以命名为二氢嘧啶酶(Dihydropyrimidinase)EC3.5.2.2.他们发现二氢嘧啶酶不仅能水解打开二氢嘧啶环，并且还可以水解与二氢嘧啶结构相类似的海因类化合物，所以二氢嘧啶酶又称海因酶(Hydantoinase)5，6。本文报道5-对羟基苯海因不对称水解生成N-氨基甲酰D-对羟基苯甘氨酸的二氢嘧啶酶的菌种筛选和发酵条件的研究。1材料1.1菌种共筛选菌种50株，包括10个属，15个种。1.2斜面培养基普通琼脂培养基1.3筛选培养基组成(%)甘油1.0，酵母膏1.0，K2HPO43H2O0.2，NaCl0.3，MgCl26H2O0.05;用4mol/LNaOH调pH至7.27.4，500ml锥形瓶装50ml液体培养基，热压灭菌30min。1.4试剂N-氨基甲酰D-对羟基苯甘氨酸根据StarkTSmyth7制备。海因，甲硫乙基海因，苯海因根据Suzuki8，Henze和Speer法制备9，对羟基苯海因根据乙醛酸法制备10。其余试剂均为市售商品。1.5仪器JHZ-82恒温振荡器；GL20A全自动高速冷冻离心机。2方法2.1培养方法接种菌种于斜面培养基，30培养24h。每支斜面培养基中加入10ml无菌水制成菌悬液，每50ml液体培养基加入1ml菌悬液，于28，170r/min发酵培养18h。取3ml发酵液5000r/min离心10min，弃上清用生理盐水洗涤菌体后，5000r/min离心，收集菌体。2.2酶活力测定：采用改进的Cecere法”11称取384mg对羟基苯海因，溶解在90ml，pH8.5，0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中制备底物溶液，37保温30min。取3ml底物溶液加到上述收集有菌体的试管中，37适度振荡反应30min，取出立即加1.0ml三氯乙酸溶液(12%)，充分振荡，于3500r/min离心30min，吸取适量上清液，补水至2.0ml，加入2.0ml对二甲氨基苯甲醛(5%，6mol/LHCl)，以零时的酶反应液样品作空白，438nm处测定光密度，根据标准曲线计算酶活力。酶活力定义：在上述反应条件中，每分钟催化生成1molN-氨基甲酰D-对羟基苯甘氨酸的酶量为1个活力单位(U)。2.3生物量测定取0.2ml不同发酵时间的发酵液，加入3.8ml生理盐水，于600nm下测光密度，以零时发酵液作空白。2.4酶反应产物的分离将具有酶活力的菌种按上述培养方法培养，收集20个摇瓶的菌体细胞，在含有3g对羟基苯海因500mlpH8.5，0.05mol/L的磷酸盐缓冲液中加入菌体，于37水浴中反应24h，每隔4h用4mol/LNaOH调反应混合物pH，保持在pH8.5左右。反应完毕，调pH到3.0，离心，将上清液冷冻干燥，得白色粉末。用乙醇提取，直到抽提液与对二甲氨基苯甲醛溶液无黄色反应为止，合并抽提液，于硅胶柱上分离，收集洗脱液，真空浓缩，过滤得无色晶体。重结晶。3结果3.1初筛在所筛选的10个属，50株细菌中，大多数有少量的二氢嘧啶酶酶活力，但酶活力较高的菌株都属于假单胞菌。如表1所示。Tab 1Result of prdliminary screeningTest organismNumberofspeciesNumberofstrainNumberofactive st rainCtinobacillus sp.240Corynebacterium sp.231Cellulomonas sp.110Staphyl ococcus sp.190Pseudomonas sp.177Xantnomonas sp.131Lactobacillus sp.230Bacillus sp.261Brevibacillus sp.160Agrobacterium sp.2823.2复筛3.2.1在二氢嘧啶酶酶活力较高的假单胞菌中，确定Pseudomonas putida D菌酶活力最高。3.2.2酶反应产物的分离和鉴定：将Pseudomonas putida D菌按材料和方法所述条件培养，酶转化，分离反应产物，测定产物的熔点，旋光度与N-氨基甲酰D-对羟基苯甘氨酸标准品数值一致。比较产物和标准品的红外光谱，证明产物为N-氨基甲酰D-对羟基苯甘氨酸。因此说明D菌产生的是能水解DL-对羟基苯海因生成N-氨基甲酰对羟基苯甘氨酸的二氢嘧啶酶。以下试验均用Pseudomonas putida D菌。3.3二氢嘧啶酶产生菌最佳发酵条件3.3.1最佳碳源筛选在含有1.0%酵母膏，0.3%NaCl,0.05%MgCl26H2O,0.2%K2HPO43H2O的液体培养基中加入各种不同碳源，进行考察，如表2所示。Tab 2Effect of various carbon sources on enzyme productionCarbon source(1%)Biomass(A600nm)Enzyme activity(U/ml)None0.270.03Glycerol0.521.68Glucose0.501.14Sucrose0.241.12Soluble starch0.351.32Lactic acid0.500.80Sodium acetate0.230.60如表2所示，在各种C源中，以甘油作为碳源对菌生长和产酶最为有利，可溶性淀粉和甘油对产酶有利，而其他碳源对产酶有不同程度的抑制作用。3.3.2最佳氮源筛选在含有1.0%甘油，0.3%NaCl，0.05%MgCl26H2O，0.2%K2HPO43H2O的液体培养基中加入各种不同的氮源，进行考察。如表3所示。Tab 3Effect of various nitrogenous compounds on enzyme productionNitrogenous source(1%)Biomass(A600nm)Enzyme activity(U/ml)None00Yeast extract0.581.83Peptone0.421.31Beef extract0.230.05Polypeptone0.481.62Corn-steep liquor0.431.23Urea00.01由表3可见，除酵母膏对产酶有明显作用外，其余氮源对产酶均无显著作用。3.3.3磷酸盐对产酶的影响在含有1.0%酵母膏，1.0%甘油，0.3%NaCl，0.05%MgCl26H2O的液体培养基中加入不同量磷酸盐，进行考察，如表4所示。Tab 4Effect of potassium on enzyme productionPotassium phosphate(%)Biomass(A600nm)Enzyme activity(U/ml)00.591.830.10.601.830.20.601.820.30.601.830.40.601.820.50.591 .82从表4可见，磷酸盐对菌生长意义不大，但适量磷酸盐可能对产酶有一些促进作用。3.3.4诱导物的影响在含有1.0%酵母膏，1.0%甘油，0.3%NaCl，0.05%MgCl26H2O，0.2%K2HPO43H2O的液体培养基中加入各种诱导物，如表5所示。Tab 5Effect of various inducers on enzyme productionInducerBiomass(A600nm)Enzymeactivity(U/ml)None0.551.83Hydantoin(0.1)0.351.74D-methylhydantoin0.601.76Methylhydantoin(0.1)0.631.61Phenylhydantion(0.1)0.330.03Methylthioehydantoin(0.1)0.632.24Adenine(0.05)0.601.956-Aminopyrimidine(0.5)0.551.97Thymine(0.05)0.501.93从表5可看出，大多数底物类似物对产酶并无太大的促进作用，但甲硫乙基海因对酶的诱导作用很显著。3.3.5培养时间与产酶的关系在上述确定的最适培养基接种培养，定时取样测发酵酶活力，结果如图1所示。Fig 1Time curve of enzyme production从图1可看出，D菌在对数生长期后期产酶达到高峰，最适培养时间为18h，这表明二氢嘧啶出现在细胞代谢和生长最旺盛时期，与细胞生长增殖有关。4讨论实验结果表明，诱导物的有无对酶活力有很大的影响，这说明Pseudomonas putida D菌产生的二氢嘧啶酶是一种诱导酶，其中以甲硫乙基海因对二氢嘧啶酶诱导作用最强。同时实验中发现腺嘌呤，6-氨基嘧啶，胸腺嘧啶对酶活力都有一定的诱导作用，可间接表明二氢嘧啶酶在核酸的代谢过程中有一定作用。培养时间与产酶曲线显示恶臭假单胞菌D菌产酶在对数生长后期达到高峰，进入停滞期，细胞酶活力不再升高，并呈剧烈的下降趋势。这表明二氢嘧啶酶出现在细胞代谢和生长最旺盛时期，与细胞生长，增殖有关系。致谢本研究所用Pseudomonas putida由我校校友，现在美国做博士后的历滔博士及其在攻读博士学位时的导师Professor john P. Rosazza提供。参考文献1Takahaski S,Ohasai T,Kii Y,et al.Microbia transformation of hydantoi ns to N-carbamyl-D-amino acids.J Ferment Technol,1979,57 (4)3282Takahaski S,Kii Y,Kumagai H,et al.Purification,crystallization and propertie s of hydantoinase from pseudomonas striata.J Ferment Technol,1978,56(5)4923Bernheim F,Bernheim M.The hydrolysis of hydantoin by vari ous tissues. J biol Chem,1946,163(3)6834Eadie G,Bernheim F,Bernheim M.The partial purification and properties of ani mal and plant hydantoinese.J Biol Chem,1949,181(2)4495Wallach D,Guisolia S.The purification and properties of hydropyrimidine hydr ase.J biol Chem,1957,226(1)2276Dudley K,Danie L.Buffer catalysis of the racemization reaction of some5-ph enylhydantoins and its relation to the in vivo metabolism of e