实用ELISA教程.ppt

Elisa实用操作手册 给师弟科普ELISA基本步骤 与其写个文档 不如直接写帖子 反正工作量一样 我自己做ELISA也只是初学者 所以说得不对的地方 请大家多多指正 ELISA有白底 上图 不可拆 和黑空板子 可拆 8个一排 12排 用吸光度 一般是450nm的OD值 来检测 就只能用白底的板子 黑底的板子可以用Lumin读数 第一步 拿到板子 还有封盖膜 第二步 用100ul包被抗体 包被好板子之后 轻弹混匀 将封盖膜的白色撕去 用透明有粘性的膜 贴在板子上 把膜压紧 贴膜是为了防止液体挥发 所以一定要把每孔黏牢 室温孵育过夜 注意事项 1 如果一次只做一部分孔 贴膜可以剪刀剪开 只用一部分 保证膜可以把加液后的孔盖住就可以 2 加样时候 一定要保证每孔加样量完全一样 避免因为操作原因 每孔液体量有区别 ELISA比较敏感 操作误差会导致最后读数有不小的差别 3 加的样 保证样品加在孔底 不要粘在管壁上 减少孔与孔之间的差异 第二天早上 来洗掉包被液 注意事项 1 ELISA用的所有液体系统 记得一定要预先调PH值到7 2 7 4之间 最好按照说明书都无菌过滤过 1XPBS的PH值在7 68左右 仍然需要加盐酸调酸一点 Trizmabase配出来 PH在9 98 必须调PH 否则ELISA中抗原抗体根本不能正常结合 蛋白对于PH值极度敏感 2 无菌要求多高 现在不知道 建议无菌配好的液体放在4度冰箱保存 每次用之前 放在室温下至少15分钟 ELISA用的液体 室温的温度 效果比较好 洗包被液的时候 直接把板子翻过来 弃掉液体 在厚厚的吸水纸上 用力拍打板子 力求把孔中的液体完全弃干净 用WASHBUFFER洗涤三次 因为孔的最大容量是400UL 但是300UL基本就可以把孔覆盖满 所以 建议洗板子的时候 每孔加350ul左右 注意事项 1 每次洗涤的时候 尽量拍干孔中液体 这样洗涤得比较干净 2 孔中没有液体时候 动作一定要快 ELISA包被后的孔 绝对不能干掉 否则非常影响结果 3 封闭 用是1 BSAin1XPBS 无菌过滤 4度保存 用之前放在室温复温 封闭液最好可以封闭全孔 所以每孔加300UL封闭液 室温1小时 4 弃掉封闭液 拍干 洗涤三遍 步骤如前 5 加标准品和样品 标准品储存浓度很高 而且蛋白很忌反复冻融 建议第一次使用时 分装 可以48孔一只 80度冰箱保存 可以有效保存半年 4度保存 有效期是60天 而且浓度会衰减 取16孔标准品的量 举例 我的标准品储存浓度是270ng ml 标准品分7个点 最高浓度是1000pg ml 每孔100ul 2倍递减 所以是1000 500 250 125 62 5 31 2 15 6pg ml 7个孔我需要0 2ng标准品 做ELISA必须有复孔 所以 两排14个孔我需要0 4ng标准品 1 5ul 标准品稀释步骤 取7个EP管 第1管放400ul缓冲液 第2到7管放200ul缓冲液 将1 5ul标准品加入到第一管中 200ul枪轻轻吹打混匀 从第1管中取200ul加入第2管中 吹打均匀 依次稀释 第7管有400ul液体 最后只用200ul 标准品加样步骤 从第1管中取100ul加到A1孔 再100ul加到A2复孔中 第2到7孔 参考上述步骤 第8孔 H1和H2加没有标准品的缓冲液 作为阴性对照 样本加样 血清或者细胞上清 解冻之后混匀 建议3000RPM离心10分钟 沉淀液体中的固体杂质 按照顺序 每孔加100ul样本 记得做复孔 加样体积一定要一样 但是动作要快 样本还是一定要保证加到管底 不要粘附到管壁上 标准品和样品 每孔100ul 室温孵育2小时 6 弃掉液体 拍干 洗涤3遍 7 加检测抗体 detectionantibody 尾端有生物素biotin 每孔100ul 储存液也是放 80度 用之前解冻后加缓冲液混匀 稀释到工作浓度 缓冲液的PH值都已经调到7 2 7 4之间 室温孵育2小时 备注 以上这些步骤没有要求避光 所以 每次加样之后 只要保证把贴膜都贴牢 防止液体蒸发和孔间干扰即可 板子可以放在操作台上 不过因为操作习惯 即使不避光的步骤 也可以把板子放在室温的抽屉里 8 弃掉检测抗体液 拍干 洗涤三遍 9 加Streptavidin HRP 亲和素 辣根过氧化物酶 这个一直4度保存 使用的时候200倍稀释 96孔 9 6ML液体 加48ul的Streptavidin HRP 9552ul的缓冲液 100ul每孔 室温 避光 这步开始要避光 孵育20分钟 10 弃掉液体 拍干 洗涤三遍 11 加底物液 substratesolution A液 B液 1 1 用之前临时混起来 储存的时候A B两液分别储存在4度冰箱 每孔100ul 等于每孔A液50ul B液50ul 室温 避光 20分钟 说明 1 加AB液之后 白色的孔就会显色 淡绿色 颜色深浅跟目标蛋白浓度正相关 2 生物素与亲和素结合 可以放大免疫反应的效应 便于显色 3 ELISA包被的板子采用平底 flat 大概60个96孔板 260美元左右 白色的板子虽然不能拆卸 但是不用的孔 只要别污染 下次可以用 所以一块板子等同于可以拆开来用 12 保留AB液在孔内 直接每孔加50ul的终止液 2NH2SO4 终止液也是公司买的专门ELISA用的 加完终止液 轻弹板子 混匀 可以看见淡绿色变为亮黄色 黄色的颜色深浅 与绿色一致 与目标蛋白的浓度成正相关 加完终止液 立即到机器上读数 选择450nm 测OD值 说明 不常做ELISA的实验室 请务必在实验之前 确认吸光度检测仪器在正常使用状态 如果仪器状态不好 读数不准 ELISA的结果也不可信 附图的板子颜色 是我昨天的结果 室温放了一个晚上之后 今早来看 颜色普遍都黄色 虽然还有颜色深浅的区别 刚做出来的时候 颜色淡的近乎白色 几乎没有黄色 X Y轴都取对数之后 可以看见点与点之间成直线 但是 R2只有0 967 一般比较好的标准曲线 应该是0 99左右 D1与D2的重复性不好 标准品浓度 125pg ml 可能是个人操作原因 根据标准品得到的公式 就可以根据OD值来计算各个样本检测浓度 关于ELISA标本收集 1 血清 室温血液自然凝固10 20分钟后 离心20分钟左右 2000 3000转 分 收集上清 如有沉淀形成 应再次离心 2 血浆 应根据试剂盒的要求选择EDTA 柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂 加入10 v v 抗凝剂 0 1M柠檬酸钠或1 heparin或2 0 EDTA Na2 混合10 20分钟后 离心20分钟左右 2000 3000转 分 仔细收集上清 如有沉淀形成 应再次离心 3 尿液 用无菌管收集 离心20分钟左右 2000 3000转 分 仔细收集上清 如有沉淀形成 应再次离心 4 细胞培养上清 检测分泌性的成份时 用无菌管收集 离心20分钟左右 2000 3000转 分 仔细收集上清 保存过程中如有沉淀形成 应再次离心 样品稀释的一般原则用户须估计样品待测因子的含量 决定适当的稀释倍数 以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围 根据待测因子含量高 中 低的不同 分别采取不同的稀释方案 高 指待测因子在40 400ng ml 一般按1