蛋白质工程在医药工业中的.doc

蛋白质工程在医药工业中的应用 蛋白质工程是基因工程同蛋白质物理化学、蛋白质生物化学研究的现代进展相结合产生的一个科学领域，广义地说这门学科所要解决的问题应该是创造和修饰蛋白质，使其具有更高的活性，更好的特异性、稳定性，乃至产生新的特性。要想达到此目的，其前提是要对蛋白质的结构功能的关系有非常透彻的了解，也就是说，要使蛋白质工程很好地运转，关键之处在于了解是什么决定了蛋白质分子的正确的空间结构、如何形成蛋白质正确的空间结构以及蛋白质的结构和功能是如何相关的。上述这些关键问题的解决，需要多学科间相关技术的相互渗透和密切协作。图6，1给出与蛋白质工程实施有关的五个主要方面。图61 组成蛋白质工程的五个土要力面及其相互关系图示 蛋白质分子的结构分析包括一级结构、二级结构、三级结构及四级结构的分析。对于蛋白质结构和功能关系研究得到的大量实验结果指出，蛋白质的生物活性不仅依赖于自身的氨基酸顺序，也依赖于其精细的构象。因此，对蛋白质工程的实施而言，尽可能详尽地获得蛋白质分子的结构信息，以便将蛋白质分子的结构特性同其特定的功能有效地联系起来，对于蛋白质分子的结构设计和预测以及其后利用基因工程的技术构建和表达新的蛋白质分子是至关重要的。可以这样说，对蛋白质分子三维结构的获得是蛋白质工程的限速步骤。蛋白质分子的结构分析不仅对天然蛋白质分子是重要的；当要测定结构设计是否合理，对已经工程化的蛋白质的结构信息也是需要的，因为这样可以发现新的结构和功能的关系，使蛋白质分子结构和功能研究进入更深的层次。然而，无论是用X射线衍射所进行的晶体结构分析，还是用核磁共振所进行的溶液构象分析，有时都存在某些技术和材料上的限制，使得人们不可能快速完成对蛋白质空间结构的有效测定。随着DNA和蛋白质测序技术的自动化、微量化，大量蛋白质分子的一级结构被测定，这样通过具体的结构测定方法得到的蛋白质三维空间结构信息远远慢于蛋白质一级结构的测定速度。那么，是否能找到一些方法，可根据蛋白质分子的氨基酸序列，来得到蛋白质空间结构的信息呢?这就是蛋白质分子结构预测技术的任务。蛋白质分子结构预测方法的完善，将对大量用常规方法得不到三维结构蛋白质的改造和结构功能研究提供有效的结构信息。尽管在蛋白质分子结构预测中近年来不断取得进展，但至今尚不能达到直接从蛋白质分子的氨基酸序列精确地预测其三维结构的水平。这是因为我们虽然认识到蛋白质分子中的氨基酸序列贮存有形成蛋白质空间结构的所有内在信息，但我们并不完全知道，或根本不知道蛋白质分子正确折叠的密码。只有当人们彻底破译了蛋白质分子折叠密码后，才能使蛋白质的结构预测完成从必然王国向自由王国的转化。 蛋白质分子设计是为蛋白质工程的实施提供设计方案。蛋白质的分子设计可以按改造部位的多寡分成三类：根据对蛋白质分子的结构分析的结果，建立起目标蛋白质的结构模型，找出对目标蛋白质性质有重要影响的可能位点，然后通过定点突变技术，在基因水平上完成特异性位点的突变，使得基因表达后所产生的突变蛋白质能具有所期望的性质。通过分子设计，在目标蛋白质分子中替换一个肽段或者一个特定的结构域。蛋白质分子中特定结构域可相对独立存在的发现给这一方法增加新的活力。蛋白质的立体结构可以看做由不同结构元什组装而成的，因此可以在不同的蛋白质之间成段地替换结构元件，期望能够转移相应的功能。对蛋白质分子进行从头设计。能够用预先决定的活性、稳定性、特异性对蛋白质分子进行剪接，从而创造出全新的蛋白质分子，这是人们在蛋白质工程实施中最终的梦想。必须指出，对蛋白质分子的从头设计的成功例子尚不多，只限于几个较小的多肽，其结构组成也相对简单，大部分是完全由。螺旋和卢折叠组成。从头设计是一个复杂的过程，只有当人们彻底掌握了一级结构决定高级结构的规仲，掌握丁高级结构与特定生物功能的相关性，即完全破译了蛋白质分子的折叠密码后，才有可能真正实现从头设计蛋白质分子。 我们可以这样说，基因工程为实现蛋白质工程已经提供了基因克隆、表达、突变以至活性测定等关键技术，而蛋白质分子的结构分析、结构设计和预测为蛋白质工程的实施提供了必要的结构模型和结构基础。蛋白质工程的实施实际上是一个由理论到实践、由实践到理论的周而复始的研究过程，对蛋白质的结构功能关系的规律性认识是一个螺旋式上升的过程。蛋白质工程不但有着广泛的应用前景，而且在揭示蛋白质结构形成和功能表达的关系研究中也是一个不可替代的手段。第一节 医用抗体的蛋白质工程 抗体分子的若干独有的特性使得其可应用于痛病的治疗。抗体分子对抗原的亲和性十分高，结合常数可达10ULmoll，而且特异性高，很少或不与密切相关的抗原结合。某些种类的免疫球蛋白能够使淋巴细胞杀死结合其上的目标细胞，这种过程称为依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。结合到目标细胞上的抗体也能够激活补体对所结合的细胞实施杀伤，这称为依赖于补体的细胞毒性(CDC)。这样，如果一个抗体能与癌细胞上的特异性或增强表达的标记物相结合，就可利用上述有关抗体的特性，利用抗体去杀死癌细胞。免疫球蛋白一般来说周转率较慢，如对于人的IgGl，其半寿期为21天，这样，可以通过控制重复给药，长期地对癌细胞进行处理，使癌细胞明显减少。由于抗体的这种性质，使人们将抗体应用于癌病的治疗进行了各种探索。然而利用通过杂交瘤方法产生的鼠源单克隆抗体来处理癌细胞有几个限制因素。首先，受IgG亚型的限制，鼠源单克隆抗体只能对人体免疫系统效应器功能产生弱的激活作用；其次，鼠源的抗体在人的血浆中有非常短的半寿期；最后，鼠源抗体容易引起人体的免疫反应，产生抗鼠源抗体的抗体来中和鼠源抗体的活性，这种人抗鼠抗体(HAMA)的产生可使人产生包括高过敏性在内的各种严重的副反应。 为了避免HAMA反应，利用人源的单克隆抗体是首先考虑到的选择。然而，开发人的杂交瘤工作并不成功。此外，用对人有害的癌细胞标记物作为抗原来对人进行免疫有悖伦理。因此，就促使人们应用蛋白质工程的方法产生嵌合抗体和人源化抗体来减少鼠单抗的免疫原性。所谓嵌合抗体就是这种抗体含有鼠源的单抗的可变结构域，这个可变结构域含有所有结合抗原的元件，而抗体的恒定区是来自于人。这种用鼠可变区和人恒定区融合形成的嵌合抗体能支持人的效应器功能和在血浆中有较长的半寿期。然而，这种嵌合抗体中的鼠源可变区仍然存在足够的免疫原性，使得妨碍重复使用这样的嵌合抗体进行治疗。 旺合单克隆抗体潜在的免疫原性可进一步通过人源化技术得以减少。只与抗原接触的抗体环区，被称为超可变序列或互补性决定区(CDR)，被嫁接到人的抗体骨架上，从而形成人源化单克隆抗体。因为这种抗体可以使人的免疫系统产生抗CDR的抗体，所以人源化的单克隆抗体仍然还有免疫原性。然而经过这种改造，这种抗体独特型反应的频率和强度将比对嵌合单克隆抗体的免疫反应低，因此，利用蛋白质工程手段对单克隆抗体进行改造，使其更适于临床应用。 一、抗体的产生和抗体的结构简介 1多肽构件的随机组合产生大量不同抗体 抗体是免疫系统的一个成分，抗体的主要作用是特异性地结合病原并将其标记，让免疫系统将其消灭之。人体是如何产生抗各种外来物的特异性抗体，人体又是如何识别所有进人体内的潜在抗原的呢?人体是通过具有不同结合特异性的巨大的抗体库来完成此任务的。对于人体来说，大约有大于lOs个不同的抗体，如果每个抗体分子都有一个自身的基因那是太浪费了，因为这样所要的遗传信息量要超过人类基因组所含的信息量。包括人类在内的脊椎动物通过巧妙的方法解决了这个问题，这就是像盖房子一样，用少数几种标准的构件盖出千姿百态的建筑物来。各种抗体就是由标准的多肽构件连接而成的，在基因组中只有几百个这样的多肽构件的信息编码。少量大的构件为抗体的恒定结构域编码，这个恒定结构域决定了抗体的效应器功能，即保证了信息传递到免疫系统。然而，抗体的抗原结合特异性仪由抗体分子中的一小部分(可变区)宋决定的。这些可变区由两个到3个不同的模块组成，在B淋巴细胞分化的过程中，这些模块在每个细胞中以不同的方式结合到一起。除了这些基因片段的重组之外，也存在一些随机机制，即在各种基因片段的融合点随意地插入一些短的、新的序列。抗体各种可能结构的多样性也通过另外方式进一步增加，即抗体分子由于两个独立的蛋白链、轻链和重链，结合成一个蛋白质复合体，而这两个蛋白链都参加抗原结合。图62给出一个免疫球蛋白G(1gG)的结构示意图。 肚擅头 一 图62 免疫球蛋白G(16G)分子及抗原结合片段Fab、单链Fv的结构示意图CDRs一互补性决定区；C1、Chl、Ch2、吨3冒恒定区；vl一轻链可变区；v厂重链町变区；肽接头一将重链可变区和轻链可变区相连的肚段；ta卜用以改变融合蛋白生物化学性质的C端延长的氨基酸序列；SS一二硫键桥2抗原结合的特异性是由超可变结构域决定的当将不同抗体分子的氨基酸序列进行比较时，在每个可变区内由315个氨基酸残基组觚： 、 可 恒成的三段肽序列具有非常大的可变性，故将这区段称为超变区，它处于抗体分子的外表面，3段来自于轻链，3段来自于重链。超变区代表着抗体与抗原的实际接触位点。因为它们形成与抗原互补的结构，所以这些区域又称互补性决定区(CDRs)。而可变区其余部分的作用是稳定超变区的空间结构，它们是通过高度的刚性片层结构形成的骨架来实现的。 3恒定区的作用是稳定抗体分子 抗体分子轻链和重链的两个可变结构域形成通常的抗原结合位点。这些结构域之间单独进行偶联通常相对较弱，因此要稳定抗体分子还需要其他的键。这些稳定抗体分子的键来自于恒定区。在恒定区的轻链、重链之间的二硫键可使其共价偶联；另外的二硫键将重链的恒定区相连成为一个二聚体，使抗体分子有两个一样的抗原结合位点。而在某类抗体中，多个这样的分子复合体被结合到一起，如IRA分子有46个抗原结合位点，而I：M则有10个抗原结合位点。 4恒定区介导效应器功能 只有在少数特殊情况下抗体靠自身行使其保护性功能。正如抗体可以防止病毒入侵目标细胞一样，中和性抗体可以抵抗细菌毒素。通过激活其他的免疫系统，体液系统是最有效的。这种激活是由恒定区所介导的，而可变结构域则是结合和标记目的抗原。 不同的恒定区可介导一整套不同的生物效应，如过敏反应是伴随I。E结合而产生的，而IRM结合可引起补体系统激活。通过模块设计可以交换恒定区而保留抗原特异性，根据需要，在免疫应答反应发生的过程中，免疫系统可以非常柔性的方式发生反应。 二、从抗血清到重组抗体 通过用特定抗原，免疫实验动物所产生的抗血清是含有不同结合特异性抗体蛋白的混合物。大体来讲，抗血清中绝大多数抗体并不与新的抗原结合，它们在用此抗原免疫前就已存在于血清中。新形成的抗体通常代表着不同抗原特异性的抗体混合物。每一种抗体对应于该抗原表面的一个抗原决定部位。因此，由于个抗原分子表面有不同的抗原决定部位，则在免疫后产生多种抗体。人们将由一种抗原产生的多种抗体称为多克隆抗体，因为每一种抗体都是由一类B淋巴细胞的克隆所产生的。 通过杂交瘤技术使得人们可以得到对一个抗原上的唯一抗原决定部位有单一限定的结合特异性的抗体，称为单克隆抗体， 重组抗体是产生抗体的第三种方法。这类抗体不再要经过免疫实验动物获得，而且通过基田工程手段在细菌或在细胞培养中取得。而这类抗体，注意的焦点是抗体的抗原决定部位。为了得到高的产率，通常不要抗体分子的其他部位，因而，这些抗体片段不再执行一个天然产生抗体的所有功能。然而它们能与酶蛋白或其他抗体等融合，这样，重组抗体就具有完全新的一套特性。重组抗体是用遗传工程手段产生的抗体片段，重组抗体可以通过工程菌来获得。与实验动物免疫和杂交瘤方法比较，重组抗体有着明显的优势：由于可直接用工程菌而不是用脊椎动物生产，可避免AIDS和肝炎等病毒的污染；产生抗体的实施过程比杂交瘤方法简便，便于培养：分析、修饰和贮存。重组抗体是从单个细菌克隆来制备的，因此重组抗体是单克隆抗体。用大肠杆菌基因文库产生抗体不需要预先免疫，可以直接产生人抗体。用基因工程技术将抗体分子与其他蛋白质融合，产生全新特性的抗体。例如，借助抗体片段可将一酶蛋白特异性地定位于肿瘤细胞上；通过设计可将两个具有不同特异性的抗原结合位点连在一起，形成一个双特异性的抗体分子，如果其中一个抗体片段能结合肿瘤细胞，而另一个能激活免疫系统，就形成一个可用于对肿瘤进行免疫治疗的双功能抗体。 现在，人们已经能用各种基因工程的方法组建抗体文库，表达抗体分子片段。对于只需要抗体的抗原结合功能的应用，可用细菌细胞表达Fv片段和Fab片段。如图6-2所示，Fy片段是最小的抗原结合单位，它由抗体的重链、轻链可变区组成，在表达操作中为了稳定Fv片段，在重链、轻链可变区中间加人适当的肽接头。Fab片段是由重链、轻链可变区及其相邻的部分恒定区组成。因这段基因在大肠杆菌细胞内表达时形成包涵体，所以经常与一分泌信号肽基因融合，进行分泌表达(图6-3)。 噬菌体显示技术及PCR技术的出现，为抗体工程的实施提供了非常有效的手段。利用这些手段可以对抗体分子的可变区进行改造，用以改变其结合抗原的亲和性和特异性，借以研究抗体分子的结构功能，也可以通过这些技术对抗体分子进行剪接，获得具有全新性质的抗体分子。抗体分子不但可在细菌细胞中表达，也可以在哺乳动物细胞中表达。在哺乳动物细胞中的表达，可使抗体正确地折叠和加工。 图63 在大肠杆菌中用以产生抗体片段的两个重组表达载体(R)利用碱性磷酸酶启动子(phoA)和细菌内毒意信号肚序列组建的分泌表达抗体Fab片段的表达载(b)利用T7启动子胞内表达单链抗体Fv片段L一肽接头；PE40C端与假单胞杆菌外菌素(PE40)融合三、抗体工程 抗体工程的出发点是改善抗体的特异性、亲和性以及在受体细胞中的可生产性。当然也包括使其特性扩展，可同时作用于不同的抗原。对于很多应用而言，只改变亲和性是不够的。在一些应用中，特别小的抗体片段是必需的；鼠抗体必须改成人抗体；再者，增加抗体分子对蛋白酶的稳定性以及正确折叠都是重要的考虑。 下面以一个特异性结合实体瘤的单克隆鼠抗体为例。这种抗体对高度特异性肿瘤治疗而言是很理想的，它可以将免疫毒素带到瘤细胞中，从而杀死瘤细胞。由于完整的抗体分子太大，不能最大限度地扩散到瘤体中，以致不能完成治疗目的。为此，必须将抗体分子变小，抗体的最小片段Fv就成了最佳候选分子。然而Fv本身不稳定，这样抗体运载体Fy和所携带的毒素可能在到达目的地之前就分开。因而，首先要使其稳定化；然后抗体的亲和性要尽可能高，这是因为抗体对抗原(即瘤细胞)的结合越好，所携带的毒素错误地在身体内传布的危险性就越小，抗体更能达到其目的地。然而，如果病人的免疫系统将这个鼠源抗体识别为外源蛋白质，则几天之后由于HAMA反应产生的人抗鼠抗体就阻断了携带毒素的鼠抗体到达瘤细胞之路，使免疫治疗归于失败。为了解决这一问题，就要对抗体进行改造。近年来，用大肠杆菌系统有效地表达所需要的特定功能的抗体技术取得突破，向人们提供了具有全新性质的医用抗体片段。以上就是对鼠源抗体改造的路子。 1鼠人嵌合抗体 如上所述，由于HAMA免疫反应直接从具有特异性结合活性的鼠源单抗在治疗中的作用就受到限制。由于绝大多数HAMA抗体是抗鼠源抗体的恒定区，使人们想到产生嵌合抗体可能解决上述问题，即将鼠单抗的恒定区换成人抗的恒定区。由于人抗体基因和鼠抗体基因都可以分别进行克隆，利用PCR技术很容易将鼠单抗可变区与人的恒定区重组到一起(参见第三章有关内容)。如图6-4所示，所得到的嵌合抗体仍然能特异性地结合抗原，而HAMA反应被减少。由于这样的嵌合抗体的恒定区(或恒定结构域)来源于人，因而它对于激活人免疫系统的某些辅助功能更有效，则可有效地激活依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)，这就是某些像这样的人源化抗体已经用到临床实验的原因。可变区叫恒定区”个 图6-4 通过交换可变区的方法产生嵌合抗体将分别来源于人和鼠的抗体基因相关部位进行重组，产生人恒定区、鼠可变区的嵌合抗体，使HAMA反应被大大减少 2来自鼠抗体可变结构域的骨架区可被人源化 如前所述，抗体的人源化可很明显地减低HAMA反应，但也产生少数抗鼠可变结构域的人抗鼠抗体(HAMA抗体)。从抗体的结构图中可以看出抗体的可变结构域可以分成为超变区(即互补性决定区CDRs)和变化性较少的骨架区，而与抗原的结合是由超变区决定的。与超变区相比，这些骨架区是保守的，这些有限的骨架区的氨基酸序列由一个紧密相关的基因家族编码。这种结构特点使人们想到，是否可以将鼠抗体的超变区嫁接到一个相关的人抗体可变结构域的骨架部位，这就是所谓的超变区嫁接的设计(图6-5)。按着这一种设想产生的第一个抗体，其亲和性比它的前体(鼠抗体)明显地降低。随着对许多不同抗体的三级结构认识的扩大，CDR嫁接所得到的结果也随之改善。现在，几个完全人源化抗体的亲和性已与鼠抗体几乎没有差别，用这样的抗体作为治疗制剂也再不受HAMA反应的困扰。 这些研究也对抗体的结构功能研究有很大促进，发现了在抗体可变区某些氨基酸是很重要的，某些氨基酸的配对对可变区的稳定性和正确折蠢是不可替代的。例如，亚组的重链可变结构域中，在67位的Phe与在9位的Gly配对；在另外亚组中处于第9位的Pro、A19或Ser与在67位的非芳香族氨基酸相关联。在71位的氨基酸残基的大小决定了重链可变结构域中的CDRU取5种可变构象的哪一种，而某些其他的氨基酸负责将超变区固定在骨架区内。在人源化抗体的操作中，这些氨基酸都不能改变。这些发现体现了蛋白质工程操作从理论到实践，再由实践到理论的过程。we吐“寸 图6-5 完全人源化抗体的组建将从杂交瘤抗体的超可变区基因与人的抗体基因嫁接，产生完全人源化抗体 他种抗体不再被人的免疫系统视为外源蛋白，由此消除HAMANI 3抗体的三维结构可在计算机上建模 R体的人源化的完成依赖于X光晶体所提供的精确的二维结构数据。如今很多不同的抗体都被结晶。对抗体结构骨架的研究表明，骨架区自身都折叠成几种彼此非常相似的形式c令人惊奇的是，绝对大多数的CDR(互补性决定区)可形成彼此相近的正则结构。至今，只有为重链可变结构域第三个超变区编码的氨基酸环区的共有结构还没有确定下来。重e可变结构域的第一个超变区自身折叠成为3种可能共有结构中的一种，而第二个超变区则取5种不同共有结构中的一种，将这些共有结构结合起来则产生15种不同的空间结构。至十，从不同抗体的可变结构域中的前两个超变区只发现7种类型的空间结构。近年来的研究d包括对轻链可变结构域中的超变区的空间共有结构的研究。基于已知的381种抗体序列，从300个可能的共有结构中只发现29种。绝大多数(876)被检测的抗体中只与29种结构中10种中的一种结构相关。 目为有限的共有结构数目使结构的预测更简化，这使得抗体成为研究蛋白质折叠规律的想分子c从一级结构预测蛋白质分子的三维结构中)是分子生物学家的梦想，然而抗体可变S苎域中的超变区提供一个从理论预测到实验检测的好模型体系，很多成功的实验都是基于N体的计算机模型。例如，靠这类模型的帮助，使Fv抗体片段通过加人二硫键得以稳定。计算机模型和从晶体、NMR实验中得来的数据相对应为结构的设计提供了可靠的依据，靠这种帮助，人们编辑出单链Fy(ScFv)抗体片段对其抗原，phenyloxazolone，结合的计算机9m。从这个结构预测中可以看出，一个氨基酸的取代使抗体片段ScFv的亲和性增加3倍。这种理性设计在未来的研究中是非常有用的。显而易见，可用其改善Fy抗体片段的特异性或亲和性。然而对抗原结合位点的从头设计，人们仍还要走很长的路，因为在结构预测中最小的偏差都能引起抗体对抗原结合的大的差别。 总之，通过抗体的蛋白质工程可以对具有特定结合活性的鼠源抗体人源化，为疾病的治疗提供安全可靠的药物。此外还可以通过同源融合、异源融合产生各种双功能抗体用于临床的治疗。第二节 组织纤维蛋白溶酶原激活因子的蛋白质T-程 组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)是一种血浆糖蛋白，其功能是将单链无活性形式的血纤维蛋白溶酶原转换成双链酶、血纤维蛋白溶酶，血纤维蛋白溶酶转而切割不溶的血纤维胶变成可溶的降解产物。tPA的这种特性使得它被用作急性心血管栓塞的溶栓制剂。用DNA重组技术通过改变LPA的氨基酸序列，可能改善tPA的功能。很多的研究者采用不同的方法对tPA的变种进行设计和评估。实验表明，利用蛋白质工程的方法刘t-PA进行改造可以改善t-PA的性质，如溶血活性、血纤维结合和血纤维特异性、与血浆抑制因子的相互作用和半寿期等。 一、有关重组t-PA 20世纪80年代，发现在血纤维存在时可以刺激t-PA的活性，于是t-PA被认为可能是一种有效的溶栓试剂。1983年t-PA基因被克隆和表达，1987年通过美国FDA的批准，用于急性心血管梗塞以及肺栓塞(1990年)。+PA是一种多结构的丝氨酸蛋白酶，全长由527个氨基酸组成，整个分子由5个不同的结构单元组成，即指区(mger，F)、生长因子区(growthfactor，C)、两个铰链区(kringlc，KI，K2)以及丝氨酸蛋白酶结构域(P)。血纤维蛋白溶酶在Arg275和11e276之间将t-PA切开，形成由A-链(从第一个氨基酸残基到第275残基，含F、G、KI和K2结构域)和B链(276527残基，含P结构域)组成的双链蛋白，其间由Cys 264一Cys 395之间形成的二硫键相连。人的t-PA分子中有35个半胱氨酸残基，形成17对：硫键，只有一个未配对的半胱氨酸。图66给出tPA分子的结构示意图。 二、产生t-PA突变体的基本原理 谈到对+PA进行改造，人们要提出如下的问题：通过突变是否可以提高溶解纤维蛋白的性质?这个在哺乳动物发育过程中已进化了千百万年的蛋白质如何来改善其功能?应该说在自然选择过程中会产生最町能好的蛋白质来溶解凝血块。然而，t-PA参与丁很多同血纤维溶酶原活化相关的细胞过程，如细胞的转移、胚胎的发生、神经元的发育以及纤维蛋白的溶解等。近来基因剔除的研究表明，tPA基因缺失的小鼠可以正常发育、繁殖和具有正常的岁龄。tPA墓因缺失的小鼠确实损伤了血块溶解和增加了内毒素诱导的血栓形成概率。在设计产生LPA突变体时人们需要考虑，通过改变蛋白质的结构会产生什么样功能的变化。改善+PA的机会是什么?从生物化学的观点来讲，至少有5个方面的可能性要考虑：(0减少+PA在血浆中的清除速率；增加纤维蛋白的特异性；减少血浆中抑制剂对t-PA的抑制：增加t-PA的酶原性；增加内源溶解纤维蛋白的活性。改变这些生化参数的可行性，可用体外和体内的实验，通过建造和测试LPA突变体的方法来完成。现在，人们已经开发出很多检测方法来研究t-PA的功能和对其各种突变体进行评估。在特异性的功能产生改变的突变体町用于评估t-PA突变体在多大程度上改变了它的溶解血纤维的活性。利用位点特异性突变所实施的蛋白质工程是理性药物设计中的一个组成部分，下面将介绍在tPA分子改造中的工作。 t-PA切成双链t-PA分子三、t。PA蛋白质工程的几个方面1减慢清除的tPA变体 通过改变tPA在血浆中清除的速率来产生具有更长半寿期的治疗药剂，是tPA蛋白质I程的一个方向。由于tPA在血循环中快速清除，所以在治疗中需要大剂量连续几小时的静脉注射以保持tPA在血中的适当浓度，不少缓慢清除的tPA突变体己被构建，使得可以一次性静脉给药。 (1)t-PA结构域缺失的突变体 通过基因工程的方法将t-PA的一个或多个结构域从其基因序列中切除，来改善t-PA的清除速率。如去除F区(6-50氨基酸残基)，Des-fingertPA在大鼠中消除速率降低91左右，而在循环中的半寿期增加20倍。如果去除G区，+PA突变体在大鼠、兔和豚鼠之中的清除率降低7591；删除F和G结构域(des 6日6t-PA)，在兔中的半寿期提高6倍，而清除率与野生型t-PA比降低90。删除KI结构域的desK1tPA，其清除速率减慢的情况与desGt-PA相似。但删除K2结构域时，desK2t-PA的清除速率比野生型还快。这些结果表明，t-PA主要的清除决定因子位于F、G、K1结构域，去除其中的仟何结构域都可引起清除速率的改变。然而这种清除速率的减少，伴随着t-PA水解血纤维的活性降低。 (2)在F、G结构域中进行特异性位点突变产生的t-PA突变体 为了避免由于缺失tPA结构域而产生主要结构的改变，利用位点突变的方法组建了各种取代突变体，并对其相对的功能进行了评估。例如在F、G中间进行的取代，产生的pr047 Gly、Lys49Asn的tPA的特异性血纤维溶解活性有很大降低。又如在F结构域的3742氨基酸残基的突变，即AshSerGlyArgAlaGin 3742SerVaValIleValSer的取代突变的t-PA，在体内其特异性的溶解纤维蛋白的潜力大约是野生型的50，但其清除速率变得慢许多。 在G结构域中进行的环结构缺失，将6769位的Tyr-Phe-Ser三个氨基酸序列缺失掉，,6769t-PA在豚鼠中的清除速率降低91。然而这些研究者并未对A6769t-PA的血纤维溶解活性进行离体和活体测定。 (3)t-PA的糖基化突变体 糖基化代表着重组t-PA中主要的不均一性的来源。在Asn 117位是高甘露糖碳水化物的结合位点，而在Asn 184和Asn 448位是复杂碳水化物的结合位点。tPA分子50以上在Asnl84位糖基化，据在Ash 184存在或缺少糖基化将t-PA分成I型和型两种。在Asn 184存在糖基化可以抑制溶纤酶催化的t-PA从单链型向双链的转化。研究指出， I型tPA的作用可较慢发生，因而更缓慢地被抑制，除了上述：个V连接的糖基化位点外，还有O连接糖基化位点，大于95的Thr 61位(处于G结构域)被岩藻糖修饰。tPA的清除速率也同糖基化有关。例如N117Q的突变，删除N117位的糖基化位点，使tPA在兔中的清除速率减慢一半，而N117QN184Q t-PA与野生型相比，其清除速率减慢70。但是单位点的N184Q和N448Q突变并不改变t-PA在小鼠血液中的清除率。也有报道，NIl7Q突变体t-PA引起清除率中等程度的减缓，而对表现出正常的血纤维溶解活性。目前已有很多与糖基化位点相关的突变体被构建，对这些突变体溶纤功能、血纤维亲和性、特异性等的综合评估，将为产生低清除速率而又不影响其功能活性的+PA突变体开辟了一条新路。 2血纤维特异性 t-PA对纤维蛋白溶酶原的活性是很独特的，其被纤维蛋白原和或纤维蛋白等生理辅助因子所调节。纤维蛋白溶酶原的激活速率在存在纤维蛋白原和不存在纤维蛋白原情况下相比，要高6倍，这种作用叫做纤维蛋白原刺激”。然而，与不存在纤维蛋白相比，在存在纤维蛋白的情况下tPA对纤维蛋白溶酶原的活性要高出40倍，因而，在存在纤维蛋白情况下tPA对纤维蛋白溶酶原的活性要远远超过存在纤维蛋白原时的活性，这就是+PA的纤维蛋白特异性。非特异性的纤维蛋白溶酶原的激活引起纤维蛋白原降解，在严重的情况下就产生出血。因此，tPA的纤维蛋白特异性和对凝血块的选择性在对工程化的t-PA突变体进行评估时是一非常重要的参数。 (1)通过t-PA特定位点的丙氨酸取代来改进t-PA的纤维蛋白特异性 为增加溶栓治疗的安全性，设法提高t-PA突变体的纤维蛋白特异性是一个基本考虑。早期的治疗程序是大剂量长时间静脉给药，由于引起纤维蛋白原的耗尽而引起出血。增加纤维蛋白的特异性，从理论上讲能限制t-PA在循环中(即存在纤维蛋白原)的活性，将其施展活性的位点定到纤维蛋白凝血块上，然而在tPA分子上什么位点或结构与纤维蛋白特异什或和纤维蛋白的激活相关仍存在争论和不能很好地确定。利用位点特异性突变的方法对t-PA进行高分辨分析将有助于确定t-PA的纤维蛋白特异性决定区。从各种突变中得到一个lvs 296 Ala、His297Ala、Arg 298Ala和Arg 299 Ala的突变体，即将在P结构域中相连(296299)的4个碱性氨基酸残基变成丙氨酸。这个突变体与野生型t-PA相比，其纤维蛋白的特异性增加。对纯化的这个突变体和野生型t-PA动力学分析表明，在存在纤维蛋白原的情况下，突变体和野生型t-PA的纤维蛋白溶酶原的KM值相似，然而在存在纤维蛋白时，对野生型和突变体t-PA而言，KM值分别减少875和75。野生型t-PA的纤维蛋白溶酶原的激活的Kcat对纤维蛋白或纤维蛋白原而言并无变化，相反，对于该突变体的Kc，在存在纤维蛋白时比存在纤维蛋白原时增加15倍。这些数据指出，野生型tPA的纤维蛋白特异性主要由于对纤维蛋白KM值减少造成的，而这种突变体纤维蛋白特异性的增加主要是由于在存在纤维蛋白原对纤维蛋白时，对纤维蛋白溶酶原激活的催化效率减少的缘故。 (2)纤维蛋白特异性突变的优化 很明显，Lys 296、His 297、Arg 298和Arg 299序列参与t-PA纤维蛋白特异性功能的调节。在丝氨酸蛋白酶中，这种四肽的插入对t-PA和尿激酶来说是独特的，在这个位置二者都有一系列高度碱性的氨基酸。通过与已知结构的蛋白酶同源化分析，tPA的这一区域是接近其活性位点裂隙中的一个暴露的环区。如上所述，利用丙氨酸取代这些残基的实验表明，这种取代突变可以提高t-PA的纤维蛋白的特异性，自此之后，很多实验沿着这条路继续下去，目的在于对纤维蛋白特异性突变进行优化，如构建7 His 297Glut-PA、Arg 299Prot-PA或Arg299Giu tPA，它们的纤维蛋白特异性有48倍的提高。 同样，为了提高tPA的血栓溶解相关的功能，利用突变技术对其进行了广泛的改造，例如产生出抗抑制剂的tPA突变体、抗纤维蛋白溶酶突变体、产生长效的纤维蛋白特异性和抗抑制剂的lPA。第三节基于蛋白质结构的小分-7-药物设计 蛋白质工程长远目标之就是蛋白质分子的从头设计，即根据所掌握的蛋白质结构与功能关系的精确规律，按照预先确定的活性和结构，对蛋白质分子进行设计、剪接，最终按人类的意愿产生全新性质的蛋白质。就近期目标而言，在对蛋白质和其配体之间结构活性关系有早够了解的基础上，设计具有绝妙特异性的小分子抑制剂将是十分可行的。全于结构的药物设计是发现和开发治疗制剂的一个新方法，虽然在理论上可用于所有的生物分子，但最成功的还是发现蛋白质的新配体。本节以利用DOCK计算机程序和以人的免疫缺陷病毒l(HIV1)的蛋白酶的三维结构为基础寻找种HIV-1蛋白酶的有效抑制剂为例，介绍基于蛋白质结构的小分子药物设计。 人免疫缺陷病毒是引起艾滋病的病毒，其基因组中所编码的几个酶蛋白在病毒的感染及其后的增殖中起着重要作用。门冬氨酰蛋白酶就是其中之一，这个酶蛋白的结构和生物化学 特性都已明晰。这个蛋白酶是病毒蛋白质的恰当加工所必需的，其切割时表现出高度的特异性。蛋白酶活性紧密调控的破坏引起HIV-1病毒感染性的丧失，因此H1V1蛋白酶(HIV1 PR)成为一个潜在的化学药物治疗靶位。 基于HIV-1PR天然底物的模拟肽化合物，在试管内和活体外的实验中都是HIV1 PR有效的抑制剂。在细胞培养中，蛋白酶抑制剂在减少病毒的负荷方面明显优于AZT药物。然而，这些抑制剂所具有的肽的性质限制了它的生物可提供性(bioavailability)和在活体内的有效性受到限制，因此需要设计有类似功能的非肽分子作为抑制剂。虽然绝大多数最初找到的非肽化合物没有像底物类似物那样的有效，但其在口服给药、能穿过脑血屏障、低免疫原性以及生物可提供性方面都有优势。自1989年以来，研究者将目光和努力还是投入到非肽抑制剂的开发上，已经发现了些非肽先导化合物，其中两个化合物已进人临床测试。 一、用DOCK发现先导化合物 DOCK计算机程序是1990年由美国加利福尼亚大学(UCSF)的Kuntz及其同事设计的，是一个最老和最广泛使用的基于蛋白质(受体蛋白)结构去寻找与其相匹配的抑制剂的方法。DOCK最新的版本DOCK30能够借助于形状互补性、静电相互作用的能量以及分子机械能米对受体蛋白配体复合物进行评估。 1989年AWlodawer等人得到了HIV1PR的晶体结构数据。此蛋白酶为同源二聚体，二聚体上有两个可开关的盖子。在催化过程中，盖子在活性位点上关闭并与肽底物之间形成很多点相互作用。在盖子下面的活性位点的腔像圆柱状的洞。在活性位点腔的底部是两个催化的门冬氨酰残基，每个酶亚基提供一个门冬氨酰残基。进行DOCK程序的第一步，是用Connolly的MS程序计算活性位点的分子表面。由一套重叠球组成的活性位点的负影像被产生。在此情况下，此酶的活性位点腔是一个长24nm、直径08nm的圆柱形的结构。此酶的负影像作为用DOCK程序寻找抑制物的基础。 DOCK算法的第二步，是通过比较内部的距离，使用X光或计算机得到的假定配体与酶蛋白活性中心的负影像相匹配，再用一系列计算、分析按下列原则找出后选化合物：与蛋白酶活性位点部位在立体结构上有好的符合；与关键的催化残基、门冬氨酸的侧链可能有相互作用。这些候选