菘蓝叶片离体培养及植株再生.doc

菘蓝叶片的离体培养及植株再生 姓名：学号：指导老师：倪苏 刘帆专业：学院：农学院2013 年 7 月菘蓝叶片的离体培养及植株再生 摘要：以菘蓝幼嫩叶片为外植体，探讨了不同外源激素种类、组合及其不同浓度对菘蓝叶片丛生芽诱导的影响，并完成了植株再生。结果表明，在MS培养基的基础上添加6-BA+NAA都能成功诱导出丛生芽；但当添加激素为2,4D+KT时则不能诱导丛生芽，且在加入6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L时长势最好，为最佳诱导出芽培养基，并在添加MS+NAA1.0mg/L的生根培养基中长出不定根。关键词：菘蓝；叶片离体培养；植株再生菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是十字花科菘蓝属二年生草本植物1，其干燥的根入药称作板蓝根，具有清热解毒、凉血利咽之功效，用于治疗盛丰感冒、发热、头痛、咽喉肿痛、扁桃体炎、急性腮腺炎、咳嗽痰多等多种生呼吸道感染疾病2，其叶片(大青叶)具有抗菌和清热解毒的功效3，是常见的大宗药材，具有重要的经济价值。为满足药材市场对大量和优质的菘蓝需求以及育种工作需求，菘蓝的组培快繁技术体系显得尤为重要，关于其组培快繁已有不少报道4-6，本试验的研究在前人的基础上优选了菘蓝叶片离体培养基，旨在为低成本、快速高效的植株种苗生产提供技术前提，同时也为菘蓝的优质育种、转基因及遗传研究等研究工作奠定基础。1 材料与方法1.1 供试材料 菘蓝幼叶（由四川农业大学农学院植物生理学系提供）1.2 试验方法1.2.1 培养基设计培养基设计如下：所有培养基均附加琼脂5g/L、蔗糖30g/L，并调整PH至5.8，其中生根培养基另外加入0.2%的活性炭，每500mL培养基分装于42支试管或10个玻璃瓶中，试管分成7支/包棉塞封口，捆扎，玻璃瓶用封口膜封口，培养基需要在高压蒸汽灭菌锅中121高温湿热灭菌20分钟后放至常温下备用。诱导培养基见表1，继代培养基选择诱导培养中长势最好的一组；生根培养基设计见表2. 表1 不同激素组合诱导培养基序号不同激素组合诱导培养基1MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L3MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L4 MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L5 MS+2,4-D2.0mg/L+KT0.5mg/L6 MS+2,4-D4.0mg/L+KT0.5mg/L表2 不同激素组合生根培养基序号不同激素组合生根培养基1MS+NAA0.1mg/L2 MS+IBA0.1mg/L1.2.2 材料处理 菘蓝植株提前一天喷施多菌灵800倍液预消毒，试验时剪下健康的先用洗涤剂漂洗后将叶片置于纱布中流水冲洗30min，再用75%酒精消毒10s，无菌水冲洗23次后，用0.1%升汞消毒8min，再用无菌水冲洗56次。1.2.3 接种在超净工作台上讲菘蓝叶片切割成约1cm2大小的小片，并用灭菌的滤纸吸干叶片表面多余的水分，用灭好菌的镊子将叶片块正面向下接种到试管中，每管一小块。1.2.4 诱导培养及数据记录接种好的叶片暗培养7天，之后光培养，并每7天记录各指标（见表3），叶片放在20下培养，每天光照12h，强度约15002000lx。1.2.5 继代光培养7天后选长势最好的培养基继代培养；从试管中取出丛生芽并切分成小块的单个的芽，接种到玻璃瓶中，每瓶4株，在同条件下继续培养。1.2.6 生根培养及炼苗移栽继代培养7天后按表2的生根培养基设置接入培养生根，长出完整根系的无菌苗拿到常温下炼苗35天后，揭开封口膜再炼苗3天左右，自来水洗净苗上的培养基，移栽至土壤中。移栽时苗床应喷施多菌灵800倍稀释液或稀高锰酸钾溶液对苗床和幼苗消毒。2 结果与分析2.1 不同激素组合对菘蓝诱导培养的影响叶片接种后一周观察记录的指标如表3所示，在光培养条件下培养7天后，各组菘蓝叶片分化效果如图1所示表3 暗培养7天后不同培养基组合启动效果观察统计表序号接种数/个污染数/个污染率/%存活数/个存活率/%叶片形态变化真菌/个细菌/个真菌细菌134000034100%叶卷曲变小，增厚，有芽点23500003085.7%出芽，叶密集，卷曲，高度2-3cm34200004198%膨大,卷曲42700002696.3%膨大,增厚,卷曲537000037100%膨大,卷曲62700002696.3%膨大,增厚图1 光培养7天后各组培养基中菘蓝叶片情况图1中从右至左分别是16组培养基，其中13组有丛生芽分化，46组无丛生芽的分化，但多少都形成了愈伤组织，而3号培养基中芽分化最多，叶片长而纤细，2号培养基数量适中但叶片较宽而短，1号培养基生长状况明显不如2、3号。就总体而言，考虑到壮苗及形成在上植株，2号培养基的激素组合最优。继代培养时，总共接种丛生芽123株，壮苗结束后存活120株，其中有1株细菌污染，未存活的苗呈现玻璃化，分析可能是由于转接时灭菌的镊子未完全冷却烫伤无菌苗使其玻璃化。2.2 不同激素对菘蓝生根培养的影响生根培养7天后，只有接入1号培养基的少量芽长出零星不定根，即加入NAA的培养基有根的分化，2号培养基中没有根的分化即加入IBA的培养基还没有根的分化，且部分死亡。分析可能的原因是NAA能较好的促进菘蓝丛生芽生根，并完成植株再生，但也不排除由于试验操作的原因导致了丛生芽的死亡以及培养时间不够植株还没有开始分化根，需要进一步加长时间培养观察。但由于时间限制，未能完成移栽试验。3 结论与讨论3.1 结论试压数据统计结果表明，在MS培养基的基础上添加6-BA+NAA都能成功诱导出丛生芽；但当添加激素为2,4D+KT时则不能诱导丛生芽，且在加入6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L时长势最好，为最佳诱导出芽培养基，并在添加MS+NAA1.0mg/L的生根培养基中长出不定根，炼苗后移栽成活可完成植株再生，但由于时间限制未能完成移栽试验并统计成活率，只能初步证明其植株再生是能够成功的。3.2 讨论 由试验结果可知，不同类型的外源激素对菘蓝叶片的诱导效果是不一样的。2,4-D+KT的组合诱导离体叶片脱分化形成愈伤组织，而6-BA+NAA的组合则诱导离体叶片再分化形成丛生芽；而不同的外源激素共同存在的情况下，不同的浓度比则对丛生芽的分化影响程度不同，随着NAA浓度的增加，丛生芽的数量在增加，BA的相对浓度开始减小，促进细胞的分裂增殖的能力自然减小，生长素类似物的作用开始凸现出来，因此丛生芽的叶片会呈现长而纤细的状态。分裂素与生长素比值低时，叶组织薄壁细胞回复分裂能力，促进不定根和侧根的分化，相反其比值高时促进不定芽的分化。参考文献1 姚振生.药用植物学M.北京:中国中医药出版社,2003:2662 金玉松.板蓝根的新用途J.开卷有益.求医问药,2003(5):32-333 陈秋芳,黄群策,秦广雍.菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立J.河南农业科学2007(7):98-1004 张丽琼,周琼,柳林,等.不同培养基对菘蓝叶片组织培养的效应J.广西热带农业,2007(6):30-315 彭丽萍,张远兵,汪露润.菘蓝离体叶片高频再生系的建立J.安徽科技学院学报,2007,21(4):14-176 苗永美,简兴,石静.菘蓝两种外植体愈伤组织诱导研究J.生物技