第三章 基因工程常用技术-9.18.ppt

第三章基因工程常用技术 一 质粒DNA的提取二 核酸凝胶电泳技术三 核酸分子杂交技术四 聚合酶链反应 PCR 技术五 DNA序列分析技术 质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技术 最常用的是碱裂解法 一 质粒DNA的提取 在强碱性溶液中 DNA双链的氢键断裂变性 当溶液恢复中性时 DNA双链复性 一 碱裂解法提取质粒DNA 1 原理 4 在变性后双链不分离 复性快 共价闭合环状的质粒DNA 5 线性染色体DNA 2 碱裂解法质粒DNA提取的步骤 1 溶菌 7 葡萄糖 增加溶液粘度 维持渗透压 防止DNA受机械力的作用而降解 震荡 EDTA Mg2 Ca2 螯合剂 抑制DNase活性 防止DNA被降解 8 溶菌酶 为糖苷水解酶 能水解菌体细胞壁的主要化学成分 肽聚糖中的 1 4糖苷键 具有溶菌作用 2 变性 10 NaOH 是强碱 提供pH 12的碱性条件 使DNA双链变性 是离子型表面活性剂 溶解细胞膜和细胞内蛋白 并结合成 蛋白质 SDS 复合物 使蛋白质 包括DNase 变性沉淀 SDS 11 3 中和 12 KAc 用冰HAc把KAc溶液的pH调到4 8 以中和NaOH变性液 使DNA复性 高浓度KAc有利于变性的大分子染色体DNA RNA 蛋白质 SDS复合物沉淀 冰HAc 13 上清液中含有质粒DNA 4 离心去除沉淀 5 纯化DNA 酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 抽提或柱层析 15 酚 比重大 能加速有机相与水相分层 减少残留在水相中的酚 蛋白变性剂 进一步抽提DNA溶液中的蛋白质 使蛋白质沉淀 防止抽提时振荡起泡 氯仿 异戊醇 16 2倍体积的无水乙醇沉淀DNA 6 沉淀DNA DNA分子以水合状态 溶于 水里 乙醇能夺去DNA分子的水环境 17 70 乙醇洗涤DNA 干燥 7 洗涤 8 贮存用含RNaseA 20 g ml 的TE溶解DNA 贮存于 20 18 TE 由Tris HCl缓冲液和EDTA配制 EDTA抑制DNase 防止DNA被酶降解 Tris HCl不含金属离子 不同于磷酸或硼酸缓冲液 利于后续操作 RNaseA 降解残留的RNA 许多公司研制出商品化质粒提取试剂盒 原理大多依照碱裂解法 但在纯化步骤上采用柱层析 20 3 影响质粒DNA产量的因素 质粒的产量受提取过程中各因素的影响 但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数 一般使用endA基因突变的E coli菌株 如DH5 JM109等 1 受体菌株 endA基因编码核酸内切酶I 在Mg2 存在下 可将双链DNA消化为7bp的寡核苷酸片断 22 常用质粒的理论产量 质粒分子大小拷贝数质粒产量 kb g ml 二 DNA的定量和纯度测定 1 紫外光谱法 原理 基于DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰 蛋白质在280nm处有吸收峰 用微量比色杯在紫外分光光度计直接测定 在波长260nm紫外光下 1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50 g ml 26 纯DNA样品 OD260 OD280 1 8OD260 OD230 2 0 OD260 OD230 2 0 有残存的盐和小分子杂质 如核苷酸 氨基酸 酚等 OD260 OD280 1 6 有蛋白质污染 OD260 OD280 1 9 有RNA污染 27 原理 利用溴化乙锭 EB 能插入DNA分子中 在紫外光照射下能发红色荧光 将其荧光强度与已知浓度的DNA 如DNAmarker 电泳条带对比 可估算出DNA含量 2 琼脂糖凝胶电泳估计 三 DNA分子量的估计 通过琼脂糖凝胶电泳 与已知分子量的DNAmarker对比得知 二 核酸凝胶电泳技术 一 电泳的基本原理 生物大分子在一定pH条件下 通常带电荷 将其置于电场中 会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移 迁移速度称电泳速率 30 摩擦系数与分子的大小 构型及介质的粘度有关 电泳速率与电场强度 分子所带的净电荷数成正比 与分子与介质的摩擦系数成反比 在生理条件下 DNA分子糖 磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态 故DNA实际上呈多聚阴离子状态 在电场中向方向迁移 糖 磷酸骨架在结构上重复 故等量的双链DNA几乎带等量的净电荷 正极 32 如电场强度一定 电泳介质相同 电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型 构型相似的分子 分子量越大 迁移越慢 分子量相同的分子 如质粒 cccDNA迁移最快 L DNA次之 ocDNA最慢 33 固体支持介质 琼脂糖 agarose 聚丙烯酰胺 polyarylamide 固体支持介质可形成复杂的网孔结构 DNA穿过这些网孔才能到达正极 分子量小 结构致密的DNA分子更易穿过网孔 泳动速度也越快 二 琼脂糖凝胶电泳 是一种线性多糖聚合物 从红色海藻产物琼脂中提取而来 琼脂糖 37 琼脂糖凝胶 琼脂糖在电泳液中加热到沸点后溶解 冷却后凝固成均匀的胶体 胨 成为很好的电泳介质 38 琼脂糖浓度 分离DNA的范围 kb 0 35 600 61 200 70 8 100 90 5 71 20 4 61 50 2 42 00 1 3 琼脂糖浓度的高低决定凝胶孔隙的大小 浓度越高 孔隙越小 分辨率越高 三 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺 由丙烯酰胺和N N 甲叉双丙烯酰胺聚合而成 40 在过硫酸铵和TEMED存在时 丙烯酰胺单体形成长链 由N N 甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由基团反应而发生交联 形成聚丙烯酰胺 为中枢神经毒物 尽量避免接触和吸入 过硫酸铵 催化过硫酸铵产生自由基 加速聚合 丙烯酰胺和N N 甲叉双丙烯酰胺 碱性条件下产生自由基 TEMED N N N N 四甲基乙二铵 42 聚丙烯酰胺浓度 分离DNA的范围 bp 3 51000 20005 085 5008 060 40012 040 20015 025 15020 06 100 聚丙烯酰胺浓度的高低决定凝胶孔隙的大小 浓度越高 孔隙越小 分辨率越高 43 0 3 2 琼脂糖凝胶电泳分辨率 60 000 100bp 3 5 20 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率 2 000 6bp 44 四 电泳缓冲液 Tris 乙酸 TAE Tris 硼酸 TBE Tris 磷酸 TPE TAE价格便宜 但缓冲容量低 TBE与TPE缓冲容量高 分离效果好 但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高 易使DNA沉淀 45 EDTA可螯合二价阳离子 抑制DNase活性 防止DNA被降解 临用时用水稀至0 5 TBE 20倍稀释 10 TBE缓冲液的配制 Tris碱108g硼酸Boricacid55gEDTA9 3g加H2O至1L 调PH为8 0 8 2 46 五 核酸电泳的指示剂与染色剂 1 指示剂 常用溴酚兰 在碱性液体中呈紫兰色 在0 6 1 1 4 和2 琼脂糖凝胶电泳中 迁移率分别与1kb 0 6kb 0 2kb和0 15kb的双链线性DNA片段大致相同 47 使样品呈色 便于加样操作 指示剂与蔗糖 甘油组成加样缓冲液 增加样品比重 确保DNA均匀沉入加样孔 在电泳中形成肉眼可见的指示带 可预测DNA电泳的速度和位置 48 49 2 染色剂 核酸电泳后 需经染色才能显出带型 溴化乙锭染色法银染色法 50 溴化乙锭 ethidiumbromide EB 能插入到DNA分子的相邻碱基之间 并在300nm波长的紫外光照射下发出红色荧光 1 溴化乙锭染色法 51 可将EB直接加到凝胶介质中 终浓度0 5 g ml 也可在电泳后 将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10 15min EB与DNA分子结合 而不与凝胶结合 DNA分子吸收EB并发出荧光 52 琼脂糖凝胶EB染色后 在紫外光下观察 可检测出 50ng的DNA 在适当染色条件下 荧光强度与DNA片段的数量成正比 53 2 银染色法 Ag 可与核酸形成稳定的复合物 用还原剂 如甲醛 使Ag 还原成银颗粒 可将电泳条带染成黑褐色 用于聚丙烯酰胺凝胶染色 优点 灵敏度比EB高200倍 缺点 银染色后 DNA不宜回收 聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果 银染10min 银染15min 三 核酸分子杂交技术 1968年 华盛顿卡内基学院的RoyBritten及其同事发明 依据 碱基互补 变性和复性 随温度逐渐降低 变性的两条单链重新形成互补双链 在高温下 核酸双链解为两条单链 利用核酸双链的碱基互补 变性和复性的原理 用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针 probe 与待测样本中的单链核酸互补配对 以判断有无互补同源核酸序列的存在 一 核酸探针 指一段带有检测标记 与目的DNA片段特异互补 已知序列的核酸片段 探针长度一般以50 300bp为宜 核酸探针的种类 放射性探针非放射性探针 寡核苷酸探针 oligonucleotideprobe 根据生物体对简并密码子的偏爱性 合成系列探针 简并探针的设计依据 参考生物体EST expressedsequencetag 数据库 进行倾向性简并序列设计 EST 对一个随机选择的cDNA克隆 进行5 端和3 端单一次测序 获得的cDNA部分序列 代表一个完整基因的一小部分 平均长度360 120bp 寡核酸探针的优点 序列短 杂交速度快 特异性强 可在短时间内大量制备 可在合成中进行标记 可合成单链探针 避免双链探针在杂交中自我复性 提高杂交效率 可检测靶序列内1个碱基的变化 寡核苷酸探针的设计原则 长度18 50bp G C含量40 60 避免同一碱基连续出现 不能多于4个 与非靶序列70 以上同源性 或连续8个以上碱基序列相同 最好不用 64 1 标记物的种类 前者更敏感 但后者保存时间较长 无同位素污染 非放射性 生物素 地高辛 荧光素等 放射性 32P 35S 125I等 二 核酸探针的标记 缺刻平移法随机引物延伸法反转录标记法末端标记法 2 探针标记方法 1 放射性同位素标记 1 Klenow酶介导的3 末端标记法 末端标记法 67 2 TdT介导的3 末端标记法 3 T4 PNP介导的5 末端标记法 69 2 非放射性同位素标记 酶促反应标记法化学修饰标记法 将标记物预先标记在核苷酸分子上 再利用酶促反应 将标记的核苷酸掺入探针中 酶促反应标记法 1 标记物 dUTP的生成 如Bio 11 dUTP Dig 11 dUTP 71 Bio 11 dUTP 生物素 Biotin Biotin与dUTP之间连接臂的碳链长度 11 Bio 广泛存在于各种组织中 若样品本身含内源性生物素 会对结果产生干扰 72 Dig 11 dUTP 地高辛 digoxigenin Dig 洋地黄植物的花和叶是Dig在自然界中的唯一来源 抗Dig抗体不会与其他生物物质结合 可满足特异性标记的需要 从洋地黄植物中提取的类固醇物质 地高辛系统标记 化学修饰标记法 利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应 将标记物直接结合到探针分子上 ABC荧光标记 ABC AvidinBiotinComplex ABC显色酶标记 ABC AvidinBiotinComplex 三 核酸分子杂交的分类 待测核酸样本先结合到固相支持物 硝硝酸纤维素膜 尼龙膜等 上 再与溶液中的特异性探针进行杂交反应 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应 液相杂交 固相杂交 液相核酸分子杂交 固相核酸分子杂交 预杂交 消除膜对探针的非特异性结合 降低杂交背景 Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点杂交 狭缝杂交菌落杂交夹心杂交原位杂交 常用固相核酸杂交方法 1 Southern印迹杂交 是将DNA分子从电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜上 进行核酸杂交的一种实验方法 1975年 由英国爱丁堡大学的EdwenSouthern创建 故称Southernblot 提取DNA样本 限制酶酶切 琼脂糖凝胶电泳分离 NaOH变性 DNA转印至膜上 预杂交 标记探针与之杂交 放射自显影或显色反应 检测杂交信号 结果分析 Southernblot的基本过程 用DNA 或RNA 探针检测DNA样品 83 水稻叶绿体DNA分别用BglII A C BamHI D F EcoRI G I HindIII J L 消化 琼脂糖凝胶电泳分离 然后与32P标记的玉米psbA探针Southern杂交 X光底片中显现阳性条带 表明含玉米psbA基因序列 2 Northern印迹杂交 1979年 J C Alwine等人发展而来 是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素膜上 进行核酸杂交的一种实验方法 方法与Southernblot类似 故称Northern印迹杂交 Northernblot 提取RNA样本 RNA变性 琼脂糖凝胶电泳分离 转印至膜上 预杂交 标记探针与之杂交 放射自显影或显色反应 检测杂交信号 结果分析 Northernblotting的基本过程 用DNA 或RNA 探针检测RNA样品 87 3 斑点杂交 狭缝杂交 spot slotblothybridization 基本过程 将变性的DNA或RNA直接点到膜上 或通过一个长形狭缝转印至膜上 膜变性 预杂交 标记探针与之杂交 放射自显影或显色反应 检测杂交信号 结果分析 DNA样品 90 简便 快速 灵敏 样本用量少 特异性不高 有一定比例的假阳性 优点 缺点 需两个靠近且不重叠的探针 一个作固相吸附探针 另一个作标记检测探针 4 夹心杂交 sanwichhybridization 优点 样品不需固定 对粗制样品即能做出可靠的检测 特异性强 只有两个探针都杂交时 才能产生可检测的信号 93 注意 为避免产生高本底信号 两探针必须分别克隆入两个非同源载体内 如一个克隆入PUC19 另一克隆入pBR322 5 菌落杂交 colonyhybridization 基本过程 将菌落从平板转移到硝酸纤维素膜上 裂解菌落 释放DNA 将DNA烘干固定于膜上 标记的探针与之杂交 放射自显影 检测杂交信号 与平板上的菌落对位 用于从大量菌落中筛选含特异DNA序列的目的重组子 6 原位杂交 insituhybridization ISH 是一种可在细胞涂片 组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术 可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性 定量及定位分析 97 优点 不需提取核酸 可完整保持组织或细胞的形态 更准确地反映组织细胞的功能状态 FISH检测HER 2基因在乳腺癌组织中的表达 FISH检测慢性粒细胞白血病的费城染色体 22和9号染色体异位 是利用耐热DNA聚合酶的反复作用 通过变性 退火 延伸的循环操作 在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术 四 聚合酶链反应技术 polymerasechainreaction PCR 1 模板 一 PCR反应系统的组成 无论哪种DNA 都要有较高的纯度 可以是DNA或RNA mRNAcDNAPCR 称为RT PCR 逆转录 RNA作为模板时 需要 RT PCR ReverseTranscriptionPCR 2 TaqDNA聚合酶 引物设计的原则 长度适宜 一般15 30bp G C含量40 60 4种碱基应随机分布 内部不应存在互补序列 两条引物之间不应有多于4个碱基的互补 3 端不应有任何修饰 5 端可修饰 如32P 生物素 荧光素 上游引物5 端 起始密码子ATG 注意 下游引物5 端 终止密码子TAA TAG或TGA 上 下游引物5 端 限制酶识别序列及其保护碱基 104 5 GGAATTCCCTATGACCCAG3 不同限制酶需保护碱基的数量不同 如 EcoRI1HindIII 3BamHI2 3PstI 4 保护碱基数量不合适 会影响限制酶酶切 保护碱基 4 dNTPs 终浓度 50 mol L 4种dNTPs浓度应相等 注意 不稳定 保存时间长会失效 1 不同的酶需不同Mg2 5 Mg2 107 EDTA鳌合Mg2 选择低浓度TE 10mMTris 1mMEDTA 如扩增效率不理想 注意调整Mg2 浓度 2 外界影响 DNA模板 引物 dNTPs的磷酸基团均可结合Mg2 模板DNA0 1 2 g引物各10 100pmolTaq酶2 5U4种dNTP混合物各200 mol LMg2 1 5mmol LddH2O 标准的PCR反应体系 100 L 1 变性温度 二 PCR参数 94 95 一般30 45sec 模板DNA完全变性对RCR能否成功至关重要 可95 加热3 5min预变性 110 2 退火温度 退火温度介于55 72 之间 一般选择Tm 5 选择较高的退火温度 可减少引物与模板非特异性结合 提