DNA粗提取与鉴定实验.ppt

DNA粗提取与鉴定实验 内容 一 课题分析 1 教学目标 1 分析DNA的性质及提取的基本思路 2 探究不同手段提取DNA的实验过程 3 掌握DNA提取的过程并灵活运用 2 背景描述生物体的性状之所以能够遗传给后代 是由于其体内具有DNA或RNA这些遗传物质 DNA是遗传物质已经通过实验证实 那么DNA究竟什么样 本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取 了解DNA的理化性质 理解DNA提取以及鉴定的原理 在一定层面感性认知DNA 一 课题分析 一 课题分析 dAMP dTMP dCMP dGMP 胸腺嘧啶 腺嘌呤 鸟嘌呤 核苷酸结构 一 课题分析 脱氧核糖 五碳糖 与磷酸分子借由酯键相连 组成其长链骨架 排列在外侧 四种碱基排列在内侧 每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连 这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列 可组成遗传密码 指导蛋白质的合成 一 课题分析 读取密码的过程称为转录 是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA 信使RNA 的核酸分子 多数RNA带有合成蛋白质的讯息 另有一些本身就拥有特殊功能 例如rRNA snRNA与siRNA 一 课题分析 在细胞内 DNA能与蛋白质结合形成染色体 整组染色体则统称为染色体组 人正常的人体细胞中含有46条染色体 染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制 细胞分裂间期又可划分为 G1期 DNA合成前期 S期 DNA合成期 G2 DNA合成后期 一 课题分析 DNA是高分子聚合物 DNA溶液为高分子溶液 具有很高的粘度 可被甲基绿染成绿色 DNA对紫外线 260nm 有吸收作用 利用这一特性 可以对DNA进行含量测定 当核酸变性时 吸光度升高 称为增色效应 当变性核酸重新复性时 吸光度又会恢复到原来的水平 较高温度 有机溶剂 酸碱试剂 尿素 酰胺等都可以引起DNA分子变性 即DNA双链碱基间的氢键断裂 双螺旋结构解开 也称为DNA的解螺旋 洋葱内表皮细胞DNA被甲基绿染成绿色 RNA被派洛宁染成红色 二 教学建议 科学的探究一般过程为 发现问题 提出假设 设计实验 预测结果 得出结论 通过本实验的设计的具体的实施 是学员能够接受科学的训练 在训练过程中举一反三 从理论到实践认知DNA的提取过程和操作原理 从DNA的物质组成 到DNA的复制时期 联系生物学现象 在理解DNA的理化性质的基础上 利用其理化性质对DNA进行分离 三 材料器具 材料 新鲜菠菜4kg 试剂 氯化钠1000g SDS500g 无水乙醇4000ml 二苯胺200ml 器材 200ml烧杯60个 试管100支 研钵30个 玻璃棒30个 纱布2包 不锈钢药勺30个 滤纸5包 仪器 天平2台 水浴锅2个 漏斗30个 DNA是大分子高分子聚合物 DNA溶液为高分子溶液 具有很高的粘度 DNA对紫外线有吸收作用 当核酸变性时 吸光值升高 当变性核酸可复性时 吸光值又会恢复到原来水平 温度 有机溶剂 酸碱度 尿素 酰胺等试剂都可以引起DNA分子变性 即使得DNA双键间的氢键断裂 双螺旋结构解开 四 实验理论基础 1 DNA对酶 高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质 但是对DNA没有影响 大多数蛋白质不能忍受60 80 的高温 而DNA在80 以上才会变性 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜 去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响 四 实验理论基础 2 DNA的溶解度DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点 选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解 而使杂质沉淀 或者相反 四 实验理论基础 3 DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液 但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精 利用这一原理 可以将DNA与蛋白质进一步分离 1 实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 但选用DNA含量相对较高的生物组织 更具有操作性 根据实验目的选取适当的材料和方法 鱼卵 猪肝 菜花 香蕉 鸡血 哺乳动物的红细胞 猕猴桃 洋葱 豌豆 菠菜 在液体培养基中培养的大肠杆菌 五 实验操作原理 2 细胞破碎动物细胞 没有细胞壁破碎较易 例如 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 同时用玻璃棒搅拌 过滤后收集滤液即可 原理 蒸馏水对于细胞来说是一种低渗液体 水分可以大量进入血细胞内 使血细胞胀裂 再加上搅拌的机械作用 就加速了细胞的破裂 细胞膜和核膜的破裂 从而释放出DNA 植物细胞 需要先用一定的洗涤剂和氯化钠溶解细胞膜 洗涤剂是一些离子去污剂 能溶解细胞膜 有利于DNA的释放 氯化钠有利于DNA的溶解 研磨 使DNA充分释放 洗涤剂等更容易充分接触细胞膜 用液氮研磨可有效的防止DNA降解 五 实验操作原理 2 细胞破碎DNA降解的原因 温度 高温 易加速磷酸二酯键的水解 湿度 参与磷酸二酯键的水解 影响DNA螺旋的形成结构 pH值 氢离子参与与催化磷酸二酯键的水解 过高或过低的pH值都易破坏氢键 氧化反应 氧化碱基中的含氮杂环 使其变性 从而进一步改变一级与二级的DNA构象 DNA降解酶 水解DNA 五 实验操作原理 3 DNA的纯化细胞破碎后主要含有蛋白 多糖和RNA等杂质 可根据DNA的性质进行纯化 首先可通过过滤 离心等方法去除不溶解的杂质 然后再进一步纯化 氯化钠中的溶解度 氯化钠浓度为2mol l时DNA溶解度最大 可在此浓度下先溶解DNA 然后过滤去除不溶解的杂质 然后在DNA溶解度最低的氯化钠溶液中 0 14mol l 使DNA析出 再过滤去除溶解在氯化钠溶液中的杂质 五 实验操作原理 3 DNA的纯化利用蛋白酶降解蛋白质 加入嫩肉粉 木瓜蛋白酶 蛋白酶K等 降解蛋白质 适当温度降解蛋白质 65 70 DNA不会被变性 蛋白会变性 不溶于水的有机溶剂 酚 氯仿等 DNA不溶于这类试剂 蛋白质可溶解在其中 通过静止或离心使有机试剂和水分离 去除杂质 DNA结合柱 硝酸纤维素膜等 在酸性条件下可结合DNA 中性和碱性条件下结合能力差 通过DNA的等电点调节其所带电荷为正电或负电 通过孔径去除大分子和小分子 五 实验操作原理 4 DNA的析出溶于水的有机溶剂可使DNA析出 水更容易和有机试剂结合 使DNA析出 如一定浓度乙醇 异丙醇 乙醇浓度一般在48 67 5 异丙醇浓度在36 以上 浓度越高效果越好 低温效果更好 杂质较多 同时 可在一定程度上出去溶于该有机试剂的杂质 5 DNA的溶解一般采用TE Tris EDTA pH8 0 缓冲液或去离子水 五 实验操作原理 6 DNA的鉴定DNA与二苯胺 沸水浴 会染成蓝色 可被甲基绿染成绿色 DNA对紫外线 260nm 有吸收作用 DNA可与溴化乙锭 EB 花青素类染料结合 可在紫外光下激发荧光 五 实验操作原理 1 植物材料的研磨 称取新鲜植物材料 菠菜 100g 表面清洗后 在研钵中充分研磨 可加入石英砂 将植物组织充分研磨 可加入适量的提取缓冲液 2 将研磨好的样品取出置于200ml烧杯中 加入100ml10 的SDS轻轻混匀 65 水浴10 15min后取出 3 用多层纱布过滤 含DNA的粘稠物留在纱布上 4 用20mL2mol L的NaCl溶液 溶解粘稠物 在20mL烧杯中轻缓搅拌3min 使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液 六 实验步骤 5 用放有两层纱布的漏斗过滤 滤液中含有DNA 6 向滤液中加入等体积的无水乙醇 或95 的乙醇 用玻棒沿一个方向轻缓搅拌 溶液中 析出 出现乳白色丝状物 用玻棒将丝状物卷起 并用滤纸吸取上面的水分 7