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无义突变的MEN1抑癌基因的表达调控【摘要】：抑癌基因(tumorsuppressorgene),又称为抗肿瘤基因,是指一系列参与细胞周期调控、基因组稳定性以及促进细胞凋亡作用的基因。在对抑癌基因突变数据库的研究中发现,抑癌基因无义突变的发生频率很高,通常占到20%-40%。无义突变(nonsensemutation)产生的直接后果就是可能合成无活性或者其它功能异常的截短型蛋白。为阻止无义突变所产生的截短型蛋白对细胞造成的潜在危害,真核细胞内存在一种称之为无义突变介导的mRNA降解机制(nonsensemediatedmRNAdegradation,NMD),该机制能够识别和降解由于无义突变导致的异常mRNA。多发性内分泌腺瘤病I型(MEN1)是一种常染色体显性遗传紊乱疾病,它的特征是甲状旁腺,胰腺和垂体前叶三种肿瘤联合发生。其致病基因MEN1于1997年被人们发现,作为抑癌基因家族成员之一,由10个外显子组成,编码610个氨基酸的高度保守蛋白menino据报道,menin可以与多种类型蛋白(MLLJunD,SMAD3,nm23)相互作用,从而在细胞内行使包括转录调控、基因组稳定、细胞分裂、细胞凋亡在内的多种功能。MEN1基因对于细胞正常生长与凋亡起到至关重要的作用。然而许多肿瘤的发生是由于MEN1突变所导致,其中80%以上突变是无义突变或是移码突变,两种突变的结果会导致含有早熟性终止密码子(PTC)的异常mRNA产生,进而可能引发NMD途径。考虑到menin结构的特殊性,如果含有PTC的mRNA可以最终翻译成全长蛋白而逃避掉NMD途径,那么其蛋白menin就可以发挥正常生理功能从而避免或者改善肿瘤的发生。值得庆幸的是,研究者发现了几种不同的抑制NMD途径方法,其中有效的方法之一是促通读药物,例如PTC124和氨基糖甙类药物G418,庆大霉素等。这类促通读药物可以有效的结合核糖体RNA,促进PTC通读。基于以上想法,我们想要研究促通读药物对于抑癌基因MEN1无义突变的影响。本实验中,我们通过分子克隆技术构建了MEN1真核表达载体,包括了MEN1基因外显子210,内含子2、3、4、6、7、8、9,将该片段连接至pcDNA3.1(-)载体当中。根据人类基因突变数据库(http:/www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php)并参考NMD途径对于基因无义突变位点的选择假说,我们构建了MEN1-Q141X、MEN1-Y312X、MEN1-Y417X、MEN1-Q442X位点进行无义突变。在完成上游分子构建得到MEN1野生型和突变型后,将野生型及其突变体转染Hela细胞中,通过实时荧光定量PCR检测其mRNA含量我们发现,无义突变体MEN1mRNA含量要低于野生型。进一步用NMD途径抑制剂放线菌酮及RNA干扰NMD关键因子UPF1处理细胞发现,当NMD途径受到抑制后,其突变体MEN1mRNA含量增加。为了在蛋白水平研究无义突变的MEN1基因表达变化,我们利用Westernblot技术来进行检测。将野生型及其突变体转染C6细胞中,48h后提取蛋白进行Westernblot检测,我们发现突变体蛋白与野生型相比表达量显著下降。此外,在促通读药物实验中,以突变体MEN1-Y312X转染Hela细胞,在加入促通读药物PTC124或者G418作用细胞后,Westernblot结果显示全长蛋白menin被检测到,并且表达量与药物处理浓度具有一定的相关性。进一步的实验数据表明,全长蛋白含量的恢复会导致细胞内凋亡因子caspase8mRNA水平升高。通过流式细胞术检测发现,恢复全长蛋白的menin会导致Hela细胞凋亡。本实验结果为通过药物促通读而抑制由于MEN1无义突变导致的肿瘤提供数据支持。【关键词】：抑癌基因MEN1基因NMD途径无义突变促通读药物【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R73-36【目录】：中文摘要10-12ABSTRACT12-14第一章文献综述14-221.1NMD途径的分子机制15-171.1.1酵母细胞中的“3UTR”模型15-161.1.2哺乳动物细胞中的“EJC”模型16-171.2人类NMD途径的重要因子17-181.2.1UPF1的结构与功能17-181.2.2SMG1的结构与功能181.3NMD途径与人类疾病18-191.4抑癌基因概述19-201.4.1MEN1基因简介191.4.2MEN1基因无义突变与疾病19-201.5本课题研究思路及方法20-22第二章人类抑癌基因MEN1真核表达载体的构建22-322.1实验材料22-232.1.1细胞、菌株和质粒222.1.2主要的酶和生化试剂222.1.3主要试剂的配置22-232.1.4主要实验仪器232.2试验方法23-272.2.1HEK-293细胞培养23-242.2.2HEK-293细胞基因组的提取242.2.3MEN1基因的克隆及表达载体构建24-272.2.4MEN1基因无义突变体的构建272.3实验结果27-292.3.1pcDNA3.1-Myc-HA-MEN1A重组质粒鉴定27-282.3.2pcDNA3.1-Myc-HA-MEN1重组质粒鉴定28-292.3.3MEN1无义突变体的构建292.4讨论29-32第三章无义突变的MEN1抑癌基因的表达受NMD途径调控32-403.1实验材料32-333.1.1细胞株与质粒323.1.2主要的生化试剂323.1.3主要试剂的配制323.1.4主要实验仪器32-333.2实验方法33-353.2.1C6、Hela的培养333.2.2重组质粒浓度的测定333.2.3重组质粒转染细胞33-343.2.4细胞TotalRNA提取343.2.5细胞总蛋白的提取及浓度测定343.2.6WesternBlot检测34-353.2.7细胞mRNA水平的测定353.3实验结果35-383.3.1野生型及突变体MEN1mRNA表达含量检测35-363.3.2野生型及突变体MEN1蛋白表达含量检测363.3.3无义突变体受NMD途径调控36-383.4讨论38-40第四章促通读药物对于无义突变体的影响40-494.1实验材料40-414.1.1细胞株与质粒404.1.2主要的生化试剂404.1.3主要试剂的配制40-414.1.4主要实验仪器414.2实验方法41-424.2.1细胞培养方法414.2.2细胞总RNA提取及qRTPCR414.2.3细胞蛋白提取及WesternBlot检测414.2.4细胞凋亡检测41-424.3实验结果42-474.3.1G418对无义突变体的影响42-434.3.2PTC124对无义突变体的