发酵液中植酸酶活性测定方法的研究.doc

发酵液中植酸酶活性测定方法的研究摘 要：以钒钼法对发酵液中植酸酶活性进行了测定，并对影响酶活性测定结果的因素进行了研究。实验结果表明，钒钼法测磷的灵敏度和线性范围分别为0.025mmol/L和0.025mmol/L0.60mmol/L；为减小植酸酶活性的测定误差，结果测定必须在颜色反应结束后的4h以内完成。研究中同时发现，发酵液含有的无机磷远远大于酶活测定产生的无机磷含量，直接用发酵液测得的植酸酶酶活是不可靠的。通过对透析2h的发酵液进行植酸酶酶活的测定，实验结果的最大相对偏差仅为7.1%。关 键 词：钒钼法；植酸酶；透析；酶活Study on analysis methods of phytase activity in fermentation brothAbstract: Determination of phytase activity in fermentation broth by vanadiu-molybdenum method and the factors influenced results were studied.The results showed that the sensitivity and linear range for inorganic phosphorus by vanadiu-molybdenum method were 0.025 mmol/L and 0.025-0.60mmol/L, respectively. Detection must be finished within 4 h after colour reaction for decrease of error. It was also found that concentration ofinorganic phosphorus in fermentation broth was much higher than that of produced by enzyme activity and determination of phytase activity directlywith fermentation broth was not reliable. The relative standard deviation of the results was 7.1% when the fermentation broth was dialysed for 2 h.Key words: vanadiu-molybdenum method; phytase; dialysis; phytase activity收稿日期：2009-12-24基金项目：泰山医学院青年科学基金项目（2008-2009）作者简介：洒荣波（1978-），男，讲师，研究方向为微生物发酵。phenotypes and receptor structure J. Yeast，2004，7(6)：559-574.9 FUJII T, HORIC Y. Further investigation on a substance isolated fromwort inducing early flocculation J. Rep Res Lab Kirin Brew Co,1975,18:75-85.10 FUJINO S, YOSHIDA T. Premature flocculation of yeast induced bysome wort constituents J. Rep Res Lab Kirin Brew Co,1976,19:45.!分析与检测 1 672010 No4Serial No217China Brewing植酸酶活力测定的准确性是保证植酸酶研究和生产顺利的基础，关于植酸酶测定方法的报道很多，主要采用比色法，但其一直存在着误差大、不能准确定量的问题1-4。目前测定植酸酶活力应用较广的有4种方法：钼酸铵-FeSO4法、钼酸铵-VC法、钼酸铵-氨基奈酚磺酸法以及钒钼法。其中钒钼法于1994年被美国分析化学专家列入AOAC（Associ-ation of Analytical Communities）标准方法，我国也于2002年将钒钼法作为测定饲用植酸酶活性的国家标准5。本研究优化所得到的植酸酶发酵培养基配方中含有3g/L的磷酸盐6，磷酸盐的作用不仅是提供酵母生长所需的磷源，更重要的作用是调整发酵液的pH值，有利于毕赤酵母的生长。但此浓度的磷酸盐在发酵过程中并没有被全部消耗掉，毕赤酵母生长所吸收的磷只占其中的一部分。由此对如何降低发酵液中无机磷对植酸酶活力测定的干扰并进而提高植酸酶活力测定的准确性进行了初步研究。1材料与方法1.1菌株巴斯德毕赤氏酵母Pichia pastoris KM71（his4 arg4aox1:ARG4）、表达载体pPIC9k为Invitrogen公司产品，外源基因为精糙脉孢菌（Neurospora crassa）植酸酶基因，载体呈线性整合在染色体上（由江南大学工业生物技术教育部重点实验室课题组构建）。1.2 主要试剂植酸酶（Sigma公司）、钼酸铵、钒酸铵、稀硝酸、植酸钠、乙酸钠均为分析纯。1.3 主要设备超净工作台，721型分光光度计，PHS-3TC型精密数显酸度计，80-2型离心沉淀器。1.4方法1.4.1无机磷测定方法准确称取0.6804g在105烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解，并定容至100mL，浓度为50.0mmol/L，加显色液显色，以无机磷浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，在波长415nm处测定吸光度值。1.4.2植酸酶活性测定方法发酵液经3000r/min离心去除菌体，上清液利用截留分子量为10000U的透析袋在去离子水中透析2h得到去除无机磷的酶液，将酶液用pH5.5的乙酸钠缓冲液稀释至合适浓度，取1mL于37预热5 min。然后加入2倍体积的5mmol/L植酸钠溶液，37 恒温反应 15min 后立即加入2mL颜色终止液。室温条件下静置10min后于3000r/min离心10min。空白对照是将酶液和终止液37温浴15min后再加入底物植酸钠。植酸酶活性单位定义：样品在植酸钠浓度为5mmol/L、温度37、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1mol无机磷为一个植酸酶活性单位（U）。2结果与讨论2.1测磷标准曲线将浓度为50.0mmol/L的磷酸二氢钾标准溶液按表1稀释成不同浓度，加显色液显色，以无机磷浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，做直线回归方程见图1。2.2钒钼法测磷的灵敏度用电子分析天平准确称取KH2PO4（称前105烘3h），配制1mmol/L浓度，稀释成不同浓度，采用钒钼法测定其中的磷含量，能测出的最小无机磷浓度即为该方法的灵敏度。实验测定钒钼法测磷的灵敏度为0.025mmol/L。2.3钒钼法测磷的线性范围配制不同浓度的无机磷，采用钒钼法测定OD415nm值，以OD415nm值为纵坐标，无机磷浓度为横坐标做出曲线，并做回归分析。凡能满足回归方程相关系数达0.99的回归直线2个端点无机磷浓度之差，即为该方法定量的线性范围。实验结果显示，钒钼法测磷的线性范围为0.025mmol/L0.60mmol/L。2.4钒钼法测磷含量的方法稳定性钒钼法的颜色反应结束后，分别放置不同时间之后测其在波长415nm处的光密度值，将不同时间测得的OD415nm值对时间做图，考察钒钼法测磷的方法稳定性，结果见图2。从图2可以看出，在颜色反应后的4h内，OD415nm值基本恒定不变；4h以后，OD415nm值缓慢增加，在14h时OD415nm值已经增加了27.7%。因此，为减小植酸酶活性的测定误差，OD415nm值的测定必须在颜色反应结束后的4h以内完成。2.5发酵液中无机磷含量对酶活力测定的影响在测定酶活的条件下，酶液分解植酸钠产生无机磷的量大约在0.6mg左右，而摇瓶诱导结束之后的发酵液中含有的无机磷却有50mg（以20mL发酵液计）左右，发酵液中的无机磷含量接近酶测定反应所产生无机磷的100倍。由于作为酶液的发酵液中无机磷含量远远大于酶测定时产生的无机磷含量，因而酶液取样的微小差异将造成酶活测定结果的极大误差。以发酵液为酶活测定液，以灭活的发酵液作对照，重复测定5次OD415nm值，其测定结果（表2）可以看出，以灭活酶液为对照测定酶活，可重复性较差，连续测5次的结果均有较大差异，测得的最大值是最小值的4.5倍，因此以灭活酶液为对照测得的酶活结果是不可靠的。因此只有去除了发酵液中的无机磷，才能得到较为准确的酶活结果。2.6去除无机磷的发酵液酶活力测定结果发酵液3000r/min离心后去菌体，在孔径10000u的透析袋中用去离子水透析，透析不同时间发酵液中无机磷的含量见表3。从表3中可以看出，透析2h后发酵液中无机磷基本去除干净。对透析2h及未透析的发酵液分别进行酶活力测定，发现透析后酶活稳定性大大提高，透析后的酶活测定结果见表4。这也表明发酵液中无机磷对酶活测定有非常大的影响，以发酵液为酶液测定酶活，去除无机磷是测定结表1 不同磷浓度下吸光度的变化Table 1. Absorbance at different concentration of phosphorous吸光度值磷浓度/（mmolL-1）0.025 0.05 0.1 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40OD415nm0.032 0.076 0.15 0.256 0.325 0.402 0.485 0.575 0.645表2 以灭活酶液作对照发酵液酶活测定结果Table 2. Results of phytase activity with control of inactiviated broth项目实验次数1 2 3 4 5OD415nm0.076 0.047 0.157 0.210 0.0701 68Analysis and Examination中 国 酿 造2010 年 第 4 期总第 217 期表3 发酵液透析不同时间的结果Table 3. Result of dialysis for different time项目透析时间/h对照 1 2 4发酵液中的磷浓度 /（mgmL-1）2.24 1.07 0 0果准确与否的关键。从表4可以看出，对透析2h的发酵液进行植酸酶活力的测定，共进行5次实验，实验结果的最大相对偏差为7.1%，符合国家标准中规定的8%的相对偏差上限5。2.7底物浓度对植酸酶反应速度的影响配制一系列不同浓度的植酸钠溶液，进行酶促反应，检测底物浓度对酶促反应速度的影响，结果（图3）可知，当植酸钠的浓度10.0mmol/L时，无机磷的生成速度与植酸钠的浓度成正比；当植酸钠的浓度10.0mmol/L时，无机磷的生成速度与植酸钠浓度不再呈线性关系。植酸酶对植酸钠具有较高的亲和性，表现出的水解能力也最强，因此植酸钠为植酸酶的最佳底物。植酸酶同其他酶一样，其活性也受到多种因素的影响。当底物植酸钠的浓度12mmol/L时，植酸酶活力受到抑制而下降。3 讨论目前植酸酶酶活力测定过程中存在测定结果误差较大的问题，一直困扰着植酸酶的研究和开发工作。发酵液中存在的无机磷对酶活力测定结果有严重的干扰作用，造成植酸酶活力测定产生很大的误差。相对于植酸酶的酶活力测定而言，反应一般在较短的时间内完成，植酸酶分解底物植酸钠所释放的无机磷比发酵液中的无机磷低的多，发酵液中的无机磷严重干扰了植酸酶活力测定的准确性。以往报道的改善植酸酶活力测定方法的研究中，主要是围绕着测定过程中无机磷的测定敏感性方面，陆文清等7认为，解决上述问题的方法是在测定植酸酶活力时，应适当加大稀释倍数，使粗酶中本身所含的无机磷浓度降低，同时增加反应时间，使水解植酸钠释放的无机磷所占比例加大，总磷与粗酶中本身所含的无机磷浓度均处在线性定量范围内，以灭活稀释酶液作空白对照。此方法对本实验却并不适合。由于实验中所使用的菌种在摇瓶培养中产植酸酶的酶活较低，一般在4U/mL8U/mL，为了使测定酶活过程中分解的无机磷在测磷的线性范围内，发酵液只需稀释15倍左右，而不能稀释更多倍数。这样，加大稀释倍数以减少发酵液中的无机磷的影响的方法便不能起到更大的作用。通过透析方法去除发酵液中的无机磷，消除了发酵液中无机磷对酶活力测定结果的严重的干扰作用，使植酸酶的酶活力测定结果准确、可靠，并为以后的植酸酶研究工作的顺利开展提供了保障。参考文献：1 石宝明,单安山. 微生物植酸酶在体外条件下活性的测定J. 中国饲料，2000，15：23-24.2 杨平平,王 燕,史宝军，等. 对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活性测定方法的初步探讨J. 食品与发酵工业，2003，29（9）：52-55.3 王 泓，张礼星. 可用于植酸酶测定的磷比色法J. 江苏食品与发酵，1997，（3）：21-24.4 陆文清，李德发，武玉波. 固体发酵植酸酶酶活测定中的影响因素及其校正J. 中国饲料，2001，（3）：25-26.5 GB/T 18634-2002，饲用植酸酶活性的测定 - 分光光度法S.6洒荣波. 巴斯德毕赤酵母高密度培养研究D. 江南大学，2005.7 陆文清，刘 伟，刘兴海，等. 固态发酵饲用植酸酶酶活的快速测定法J. 饲料研究，2000，（3）：35-37.表4 透析2h后发酵液酶活测定结果Table 4. Results of phytase activi