细菌的噬菌体.ppt

细菌的噬菌体 一 一般性状 侵染细菌的病毒称为细菌的噬菌体 简称噬菌体 噬菌体由核酸和蛋白质外壳构成 噬菌体有丝状的 球状的 但大多数为蝌蚪状的 蝌蚪状噬菌体 噬菌体的侵染 噬菌体接触到对它敏感的细菌时 它以尾部末端吸附细菌 其中DNA通过尾部注入到细菌细胞内 蛋白质外壳还留在细菌体外 注入细菌细胞内的DNA 控制和改变了细菌的代谢活动 并在其中复制噬菌体的DNA和蛋白质外壳 然后组成新的噬菌体 细菌就全部消解并释放新噬菌体 噬菌体的侵染 噬菌体的侵染 噬菌斑 培养的细菌被侵染后就会发生明显变化 原来混浊的细菌悬浮液就会变清 在琼脂平板上的细菌就会出现无菌的透明斑 称为 噬菌斑 噬菌体都有一定的寄生范围 有的寄生范围广 可以侵染一个属中不同种的细菌 甚至不同属的细菌称为多价噬菌体 有的寄生范围窄 仅能侵染同一种细菌 甚至种内的一个菌系 称为单价噬菌体 前者在研究细菌亲缘关系有作用 后者在细菌的鉴定上应用 噬菌体的侵染范围 二 研究方法 噬菌体的分离噬菌体的纯化噬菌体的繁殖噬菌体的保存 1 噬菌体的分离 噬菌体的存在与寄主细菌有关 一般从寄主细菌所在的场所可以分离获得 植物病原细菌的噬菌体 可从感病植株的感病部位 病残体或者感病植株生长的土壤中分离获得 在土壤中分离时 因为土壤中杂菌较多 分离的噬菌体也可能不是单价的噬菌体 这时需要进行目标菌的诱发 即把目标菌倒入土壤中 过一段时间后 再从土壤中分离噬菌体 分离举例 病组织提取液获得 将病组织切碎加水研磨 滤纸过滤 滤液5ml加入试管中 加1 2ml氯仿 加塞充分摇匀 静止30 60min 待分层 用灭菌吸管取上层液作平板分离琼脂平板分离 提取液1 2ml和浓细菌悬浮液 109 ml 1ml加入培养皿中混合 再加入45 肉汁胨培养基 或其他培养基 待培养基凝固后 26 28 培养 如果有噬菌体 10 12小时后 琼脂平板上即可见噬菌斑 如果从土壤中分离 可用样本加水提取 离心 上清液1ml接种到30ml培养液中 内接1ml浓细菌液 25 过夜 离心除去细菌 氯仿处理 平板分离 分离液中的杂菌去除 氯仿处理 滤液 氯仿 5 20 1 摇匀 静止分层 取上清液作分离用 离心处理 6000 8000转 分 10分钟 可除去分离物中大部分杂菌 细菌滤器过滤 用5 6号细菌滤器过滤 此方法也会使噬菌体减少 加热处理 噬菌体的致死温度一般高于细菌 可用55 60 处理提取液 以杀死细菌而不影响噬菌体 以上方法可以根据情况确定 有时需要几种方法配合使用 平板分离 分离噬菌体的培养基 一般选用寄主细菌生长良好的培养基 固体和液体培养基均可 细菌菌龄 分离所用的细菌菌龄对噬菌体的繁殖影响很大 最好用对数生长期前的细菌 一般24 48小时 分离方法 1 提取液和细菌悬浮液混合涂抹于琼脂平板表面 2 提取液 细菌悬浮液和45 琼脂培养基混合 放置 26 28 培养 10 12小时后 琼脂平板上即可见噬菌斑 2 噬菌体的纯化 从一个样本分离获得的噬菌体 可能不是同一个噬菌体 需要进一步纯化 噬菌体的纯化和细菌的纯化相似 噬菌斑就相当于细菌的菌落 纯化的方法是选择单个噬菌斑 用挑针刺一下 洗在约1ml灭菌的0 1 蛋白胨液中 就有足够的噬菌体 一个噬菌斑的噬菌体量很大 直径约2mm的噬菌体数量可达107 109个噬菌体 配成的噬菌体悬浮液 按1 10的比例用0 1 蛋白胨水稀释若干次 然后用琼脂平板法培养 即可得到纯的噬菌体 3 噬菌体的繁殖 纯化的噬菌体 繁殖后可用于性状的测定和保存 一般用三角瓶液体振荡培养寄主细菌 培养24 48小时后 接种一小块噬菌斑 再继续培养一段时间 待混浊的细菌悬浮液变清后 用细菌滤器过滤 除去残留的细菌 即为噬菌体悬浮液 4 噬菌体效价测定 噬菌体的效价是指噬菌体的浓度 或者每毫升含噬菌体的数量 效价测定 将样本按1 10的比例稀释6 8次 在灭菌培养皿中加入不同倍数的稀释液 再加入浓细菌液和45 的培养基 培养12小时 检查噬菌斑的多少 一个噬菌斑被认为是由一个噬菌体繁殖起来的 噬菌斑 5 细菌的鉴定 噬菌体用于鉴定之前 必须测定其寄主范围 测定时使用寄主和地理来源相近的菌株 单价噬菌体 只能侵染原来用于分离的寄主细菌 这类噬菌体就只能用于这类细菌的鉴定 分布等方面研究 多价噬菌体 能侵染多种细菌 往往用几个多价噬菌体组合 研究不同细菌间的亲缘关系 鉴定方法 1 噬菌体样本多时的测定方法 噬菌体样本较多时使用此方法 在平板上先用涂抹棒接上目标细菌 横向涂抹 细菌生长24小时后 再纵向涂抹不同的噬菌体样本 一个平板上可测定几个噬菌体样本 培养后观察划线部位是否出现噬菌现象 划线测定 2 细菌亲缘关系测定 培养皿中加1ml待测定的噬菌体悬浮液 再加入45 肉汁胨培养基 混匀 待琼脂平板凝固后 用灭菌的移植环蘸不同的细菌悬浮液在平板上划线 培养后观察测定的细菌能否生长 6 噬菌体的保存 用0 1 蛋白胨液或肉汁胨培养液培养细菌 繁殖噬菌体悬浮液 过滤灭菌后保存 方法1 将噬菌体悬浮液装入灭菌安瓶中 封口 4 保存 可保存几个月或几年 方法2 试管中先加入氯仿 再在其上面加噬菌体悬浮液 比例为1 1 20 不能用冷